293T细胞在做免疫荧光共聚焦的时候怎么保证不脱落啊？

293T细胞在免疫荧光共聚焦成像时，如何防止细胞脱落，确实是个需要细致操作的环节。我之前也遇到过不少次，细胞因为各种原因“跑路”，影响结果，后来总结了一些经验，跟你分享一下，希望能帮到你：

核心思路： 确保细胞在处理过程中“安稳”地附着在载玻片或盖玻片上，并且在后续染色、洗涤、成像等环节，尽量减少对细胞的物理冲击和化学刺激。

一、 细胞培养与准备阶段：打好基础

1. 选择合适的载体：
盖玻片（Cover Slips）： 这是最常用的，尤其是小尺寸（如12mm、15mm）的圆形或方形盖玻片。它们易于在培养皿中放入，也方便后续转移。
载玻片（Slides）： 如果你需要在大的区域上观察，或者直接在载玻片上培养，也可以选择。但要注意，培养皿底部比载玻片平整，更利于细胞均匀贴壁。
特定成像皿（Imaging Dishes/Plates）： 有些特殊设计的显微成像皿，底部带有高质量的盖玻片，适合需要精细观察的实验，但成本较高。
关键点： 无论选择哪种，一定要保证载体表面是干净、无油、无灰尘的。最好在使用前用70%乙醇擦拭消毒，然后在火焰旁干燥，或者放入烘箱烘烤一下（特别是玻璃载玻片）。

2. 细胞贴壁是关键：
贴壁能力： 293T细胞是比较容易贴壁的细胞，但也要保证其良好的状态。细胞状态不好（例如传代次数过多、培养基不合适、污染等）都会影响贴壁。
铺板密度： 不要铺得太稀疏，也不要太密集。太稀疏时，边缘细胞可能更容易受到冲击；太密集时，细胞之间互相挤压，也可能在洗涤时被冲掉一部分。根据你的成像需求，摸索一个合适的密度。通常，在铺板后24小时，细胞应该达到6080%的汇合度。
培养时间： 铺板后给足细胞贴壁和生长的至少24小时。时间太短，细胞还没完全牢固附着。

3. 培养基的选择：
含血清的培养基： 通常使用的DMEM或MEM培养基，里面含有10%的胎牛血清（FBS）。血清中的一些成分可以帮助细胞更好地附着。
避免使用含有 EDTA 的洗涤液（在非常规情况下）： 平时我们用PBS洗涤，而EDTA会解离钙离子，从而影响细胞间的连接。在免疫荧光过程中，我们要严格避免使用含有EDTA的缓冲液进行洗涤，除非你的实验设计需要。

二、 免疫荧光处理过程中的注意事项：步步为营

1. 固定（Fixation）：
常用固定剂：
多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）： 通常使用4% PFA（溶解在PBS中），室温固定1530分钟。PFA可以很好地固定细胞结构，同时也能增强细胞的附着力。
甲醇（Methanol）： 有时也用冷丙酮（20°C）或冷甲醇（20°C）固定，通常固定515分钟。这种方法对细胞膜和细胞骨架的固定效果更好，但可能会导致细胞脱水，稍微增加脱落风险。
固定过程： 缓慢、小心地倾倒固定剂，避免直接冲击细胞层。例如，可以将固定剂沿着培养皿的内壁缓慢滴加，让它慢慢覆盖细胞。
固定后的洗涤： 固定后，需要用PBS洗涤35次，每次洗涤35分钟。洗涤时，同样要温柔操作。将PBS沿着培养皿内壁缓慢滴加，避免直接冲刷细胞，然后小心倾倒废液。

2. 透化（Permeabilization，如果需要）：
常用透化剂： 0.1%0.5% Triton X100 或 NP40（溶解在PBS中），室温孵育515分钟。
透化过程： 同样要缓慢滴加透化剂，然后轻轻摇晃培养皿，让透化剂均匀接触细胞。
透化后的洗涤： 透化后也需要用PBS洗涤，注意操作的轻柔。

3. 封闭（Blocking）：
常用封闭液： 通常使用含15% BSA（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉（Skim Milk Powder）的PBS。
封闭作用： 封闭是为了减少非特异性抗体结合。
封闭过程： 缓慢滴加封闭液，覆盖整个载体表面，室温孵育30分钟或4°C过夜。不要剧烈摇晃。

4. 一抗孵育（Primary Antibody Incubation）：
稀释度： 严格按照抗体说明书推荐的稀释度。太浓的抗体可能会增加非特异性吸附，反而不好。
孵育条件： 通常在室温孵育12小时，或者4°C过夜。在孵育过程中，尽量不要移动培养皿，或者只进行非常轻微的摇晃。
防止干燥： 如果是在室温孵育，最好将培养皿放入一个湿盒（Humidified Chamber）中，防止抗体溶液蒸发，导致细胞干燥和脱落。湿盒可以用一个盖子盖住的培养皿，里面放一张湿润的滤纸。

5. 洗涤（Washing，一抗后）：
洗涤液： PBS或含0.1% Triton X100的PBS（PBST）。
洗涤次数与时间： 通常洗涤35次，每次5分钟。
关键操作： 倾倒废液时，要非常非常轻柔！ 可以将培养皿侧过来，让液体慢慢流出，避免直接倒扣。加入新的洗涤液时，沿着载玻片/盖玻片边缘缓慢滴加，避免形成涡流冲刷细胞。

6. 二抗孵育（Secondary Antibody Incubation）：
避光： 荧光抗体对光敏感，所以这一步和后面的步骤都需要避光操作。
孵育条件： 同一抗体，通常在室温孵育1小时，或者4°C过夜。
防止干燥： 同样要做好湿盒保护。

7. 洗涤（Washing，二抗后）：
同上： 同样需要温和洗涤35次。

8. 复染（Counterstaining，如DAPI，如果需要）：
复染过程： 按照说明书操作，通常在室温避光孵育几分钟。
洗涤： 同样需要轻柔洗涤。

9. 封片（Mounting）：
封片剂： 选择合适的荧光封片剂，如Vectashield、ProLong Gold等。
操作：
准备载玻片： 在干净的载玻片上滴一滴封片剂。
转移盖玻片： 这是最容易导致细胞脱落的环节之一！
温柔转移： 用镊子小心地夹取带有细胞的盖玻片（通常是从培养皿的角落夹起）。
将细胞面朝下： 将盖玻片细胞面朝下，轻轻地放在载玻片上的封片剂上。
避免产生气泡： 尽量在边缘开始接触，然后缓慢放下，避免产生大的气泡。
不要压片： 盖玻片放下后，不要再用力按压，让封片剂自然铺开。
如果是直接在载玻片上培养： 直接在载玻片上滴加封片剂，然后盖上干净的盖玻片（如果需要），轻轻压平。
封片剂的选择： 有些封片剂本身就能增强细胞的附着力，同时还能固定样品。

三、 共聚焦显微镜成像阶段：小心翼翼

1. 显微镜载物台：
固定： 确保载玻片或成像皿在载物台上放置稳妥，不会晃动。
避免震动： 尽量在没有明显震动的环境下进行成像。

2. 聚焦（Focusing）：
缓慢调整： 在寻找焦点时，缓慢、轻柔地转动调焦旋钮。有些显微镜有粗调和细调，只使用细调进行精确聚焦。
避免机械冲击： 镜头下降碰到盖玻片，这种物理冲击是细胞脱落的直接原因。

3. 扫描速度（Scan Speed）：
适中： 如果扫描速度过快，可能无法获得足够的光信号，需要增加激光强度，而快速扫描本身也可能对细胞产生一定的剪切力。
平衡： 找到一个平衡点，既能获得良好的图像质量，又不至于因为速度过快而导致细胞脱落。

4. 激光强度与曝光时间：
避免过曝： 过高的激光强度和过长的曝光时间不仅会增加光毒性，也可能导致一些细胞结构被破坏，间接影响附着。
优化： 仔细优化激光强度和曝光时间，在不损失细节的前提下，尽量降低。

5. Z轴扫描：
步长： Z轴扫描的步长不要设置得过大，尤其是在扫描细胞内部结构时。
避免来回扫： 尽量一次性完成Z轴扫描，避免过度反复的聚焦和扫描。

总结一下，预防293T细胞在免疫荧光共聚焦过程中脱落的几个核心要点：

细胞状态良好，贴壁牢固。
载体清洁无污染。
整个操作过程中，所有液体（固定剂、洗涤液、抗体、封片剂）的加入和倒出都要尽量轻柔，避免形成水流直接冲击细胞。
充分洗涤，但洗涤过程要温柔。
封片过程中，盖玻片的转移要极其小心，细胞面朝下，避免产生气泡和压迫。
显微镜成像时，聚焦轻柔，避免机械碰撞，优化扫描参数。

这些都是我在实践中摸索出来的经验，有时候一点点的细节处理，就能带来很大的改变。希望对你有所帮助！多尝试几次，慢慢就能找到最适合你的操作流程。

两个办法，一个是楼下说的Coat玻片，另一个是直接用HEK293-MSR细胞，稳转了巨噬细胞Scavenger Receptor。贴壁特别紧，其他和293没区别，能买到。