什么是「单细胞 RNA-seq」？这一技术对生物学研究有何意义？
想象一下，我们试图理解一个庞大而复杂的城市，但我们只能看到这座城市的全貌，却无法深入了解其中每一个居民的独特性格、工作、生活习惯以及他们在城市运行中所扮演的独特角色。传统的生物学研究，尤其是对组织或细胞群体的分析，在某种程度上就如同我们只能看到城市的整体轮廓。我们知道这里有肝脏细胞、有免疫细胞，但它们内部的差异、它们在不同状态下的细微变化，往往被平均化、被淹没在群体之中。
而单细胞 RNAseq（Singlecell RNA sequencing，scRNAseq）这项技术的出现，就像是赋予了我们一双能够深入城市每一个角落，甚至能够听到每个居民低语的眼睛和耳朵。它允许我们以前所未有的分辨率来解析生物体中单个细胞的转录组信息，也就是每个细胞在特定时刻“正在表达哪些基因”。
单细胞 RNAseq 到底是如何工作的？
要理解它的意义，我们首先需要了解它是如何实现的。简单来说，scRNAseq 技术主要包含以下几个关键步骤：
1. 细胞分离（Cell Isolation）： 这是第一步也是至关重要的一步。我们需要将包含目标细胞的组织（例如肿瘤组织、大脑、血液等）进行处理，使其分离成单个、活着的细胞悬液。常用的方法包括机械研磨、酶消化（如胰蛋白酶、胶原酶）以及机械过滤等。在这个过程中，保持细胞的完整性和活性至关重要，否则就无法获得准确的转录组信息。
2. 细胞条形码化（Cell Barcoding）： 这是 scRNAseq 的核心创新之一。由于后续的测序是批量进行的，我们需要一种方法来标记每个细胞，以便在数据分析时能够区分来自不同细胞的 RNA 分子。最常见的方法是使用带有独特分子识别码（Unique Molecular Identifier, UMI）和细胞特异性条形码（Cellspecific barcode）的微珠或液滴。当一个细胞被包裹在一个液滴中时，其 mRNA 分子会与这些带有特定条形码的微珠结合，从而将每个细胞的 RNA 标记上独一无二的“身份标签”。
3. 反转录与文库构建（Reverse Transcription and Library Preparation）： 标记了细胞条形码的 mRNA 分子会经历反转录过程，转化为 cDNA（互补 DNA）。随后，这些 cDNA 会被扩增并进行一系列处理，构建成适合高通量测序的文库。这个过程中，UMI 也能帮助校正由于 PCR 扩增带来的误差，提高数据准确性。
4. 高通量测序（Highthroughput Sequencing）： 构建好的文库会被送往测序仪进行大规模测序。测序仪会读取大量的 cDNA 片段，并记录下其序列信息，包括基因的名称以及每个片段所属的细胞条形码和 UMI。
5. 数据分析（Data Analysis）： 这是 scRNAseq 研究中另一个至关重要且复杂的部分。通过生物信息学方法，我们可以：
去卷积（Deconvolution）： 根据细胞条形码将测序数据分配到各自的细胞中。
比对（Alignment）： 将 cDNA 片段比对到参考基因组，识别出表达的基因。
定量（Quantification）： 基于 UMI 数量来估计每个基因在每个细胞中的表达水平。
细胞类型鉴定与分群（Cell Type Identification and Clustering）： 通过分析不同细胞的基因表达模式，将具有相似表达特征的细胞聚类在一起，从而识别出不同的细胞类型或亚群。
细胞间通讯分析（CellCell Communication Analysis）： 通过分析细胞之间表达的信号分子和受体基因，推断细胞间的相互作用。
发育轨迹推断（Trajectory Inference）： 对于发育或分化过程中的细胞群体，可以根据基因表达的渐变来推断细胞的发育路径和命运。
scRNAseq 对生物学研究的深远意义
这项技术的出现，彻底改变了我们看待生物体的方式，其意义体现在多个层面：
揭示细胞异质性，打破“平均化”的壁垒： 在任何组织或细胞群体中，都存在着大量的细胞异质性。这些异质性是细胞执行不同功能、响应不同信号以及在疾病状态下表现出不同行为的根本原因。scRNAseq 能够精细地捕捉到这些差异，让我们看到之前被平均化所掩盖的细胞亚群。例如，在免疫系统中，同一个“T细胞”群体中也存在着各种不同的亚型，它们的功能和激活状态千差万别。scRNAseq 可以精确地描绘出这些细微差别，为我们理解免疫系统的复杂调控提供关键线索。
发现新的细胞类型和亚群： 通过对大量细胞的转录组进行扫描，scRNAseq 可以识别出那些在传统技术中难以区分的稀有细胞类型或新型细胞亚群。这些新发现的细胞可能在组织发育、功能维持或疾病发生中扮演着关键角色，为我们深入理解生物过程和疾病机制开辟了新的方向。
解析发育和分化的动态过程： 生物体从一个受精卵发育成一个复杂的个体，这是一个极其精密的动态过程，涉及大量的细胞分化和重塑。scRNAseq 能够捕捉到不同发育阶段的细胞转录组信息，通过“轨迹推断”等分析方法，重构出细胞从一种状态向另一种状态转变的路径，让我们有机会“实时”观察细胞命运的决定和分化过程。这对于理解胚胎发育、干细胞分化以及组织再生具有革命性的意义。
理解疾病的细胞基础： 许多疾病，特别是癌症、神经退行性疾病和自身免疫疾病，其发生和发展都与特定细胞类型的异常功能或数量改变密切相关。scRNAseq 可以帮助我们识别在疾病状态下发生转录组变化的细胞亚群，了解它们的功能异常，甚至推断出导致疾病的分子机制。例如，在肿瘤微环境中，scRNAseq 可以区分肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞等不同细胞的状态，揭示它们之间的相互作用如何促进肿瘤的生长和转移。
药物研发与精准医疗的基石： 通过对疾病细胞的精准刻画，scRNAseq 可以为药物研发提供更明确的靶点。例如，如果我们发现某种药物能特异性地抑制某个在癌症发生中起关键作用的细胞亚群的基因表达，那么这种药物的开发就有更高的成功率。此外，在精准医疗领域，通过对患者个体细胞的分析，可以预测药物的疗效或毒性，实现更个性化的治疗方案。
构建高分辨率的细胞图谱： 随着技术的不断发展，科学家们正在利用 scRNAseq 技术构建各种生物体的“细胞图谱”，例如人类细胞图谱计划（Human Cell Atlas）。这些图谱就像一本详细的生物体“生物词典”，记录了不同组织、不同器官中所有细胞类型的基因表达特征，为未来的生物学研究提供了一个前所未有的参考框架。
总而言之，单细胞 RNAseq 技术不仅仅是一种更精密的测量工具，它更是一种认识生物世界全新视角。它让我们能够从原子般的细胞层面去理解生命活动，揭示那些隐藏在群体平均值之下的精妙机制。这项技术的发展，无疑正在以前所未有的速度和深度推动着生命科学的边界，为我们解决重大健康问题和探索生命奥秘提供了强大的武器。
网友意见
单细胞RNA-seq被评为2018年重大科研进展，但实际上这是老技术。2015年，商品化单细胞RNA测序流程已经建立，成果发表在Cell上。今年井喷式发文章，关注点那么高，是因为最近这项技术全面商品化了。
1. 什么是RNA-seq？
细胞是房子，DNA是房屋设计图，RNA和蛋白质就是砖瓦木石。以DNA为模板，转录成RNA，RNA翻译成蛋白质，盖好房子，发挥功能。
RNA-seq，测序测的是细胞有多少种RNA，每种RNA量有多少，由此判断这些细胞处于什么状态，这些RNA发挥哪些功能。
2. RNA-seq从多细胞到单细胞的发展史：
最早的RNA-seq，把一大群细胞混在一起，抽出RNA一起测序。由于所使用的管子枪头等器材容易粘附RNA，实验中多次样品转移，容易损耗样品。最一开始往往需要100万个细胞。
然而，有些特殊类型的细胞非常难拿，提供不出大量细胞测RNA，2012年前后，更新出微量RNA抽提测序技术。使用低粘附材料，实验流程减少样品转移次数，优化RNA反转录和扩增效率，优化建库流程，1000个细胞就可以完成一次测序。
2015年，到了单细胞RNA测序时代。
商品化的单细胞测序思路和微量细胞RNA测序相同，降低样品损耗，只不过以前实验在管子里做，现在在油相里做（即 整合了10x Genomics的Drop-seq）：
把单细胞吸入毛细管（溶液水相，含RNA反转录扩增的原料，以及带Barcode标签引物的珠子），珠子伴着细胞打入油相，一个细胞连一个珠子，包括一部分含反转录原料的溶液，被封闭在一个油滴里。
油相里裂解细胞，进行RNA反转录扩增，RNA扩增完，这个细胞所有转录组表达信息都跑到珠子上，还带有这个细胞特有的标签。最后上万个带有各自标签的珠子一起大量扩增测序，根据标签区分这些RNA表达信息来源于哪个细胞，一次测序能做一万个细胞。
2017年，该技术商品化机器大量推行；2018年相关机器进入中国市场，未来几年内，单细胞RNA测序文章还会继续井喷式产生。
3. 单细胞RNA-seq可以干什么?
这里可以举几个国内单细胞RNA测序大佬，看下他们组的工作，就能感受这技术能做什么。一个是北大汤富酬和协和乔杰老师；一个是浙大的郭国驥老师。
4. 单细胞RNA-seq的问题：
首先，细胞越少，低丰度RNA就越不容易测准，这是所有微量样品技术的通病。
其次，mRNA要翻译成蛋白质才能发挥作用，而大多数转录组和蛋白组的联合组学文章中，mRNA和蛋白质的相关度只有0.4到0.6。从RNA到真正发挥功能，还有很长一段路要走。这是用RNA测序预测功能的天然劣势。
最后，目前RNA测序技术是进步了，相关生物信息学分析还很薄弱，光靠KEGG通路分析，GSEA基因分析，很难做出实质有用的信息。做算法的有志青年们，要加油啊。
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