基因编辑具体怎么操作的呢？ 第1页

大家对基因编辑技术并不陌生，这是一门特异性靶向改变遗传物质序列的技术。

近年来，基因编辑技术发展迅速，从第一代DNA核酸酶编辑系统ZFNs、第二代TALENs到第三代CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统。

2012年zhang feng等人在体外重构了该系统并且在人类细胞中证明了CRISPR/Cas9的基因编辑能力，随着技术不断革新，不仅仅是基因敲除，基因插入的成功率变得越来越高^[1]。

基因编辑并没有被法律禁止，只是人体伦理部分的实验被禁止，当然违反人伦这事在任何技术应用上都是不允许的，(我不知道都敲了几十个基因了也没人来抓我啊：）)

基因编辑除了在治疗上起作用，在各大生物化学实验室中也作为作为一种普遍的基因编辑工具得到广泛运用，常用的就是将你感兴趣的片段敲除或者插入你的研究对象：大鼠、小鼠、斑马鱼、线虫、各种植物，各种细胞来进行研究。或者采用商业化的Lentiviral CRISPR gRNA Library文库来进行感兴趣位点的高通量筛选，比如筛个药物靶点之类的。

本文从选定基因，设计序列，到转染，筛选，鉴定到获得成功的单细胞一条龙服务介绍，做完这一套，大概需要两三周之久。（如果遇到挫折也许会更久）

实验步骤参考见文末，^[2][3][4]本文实践并经过本实验室各位师兄师姐的心血获得不断改进。可直接用作protocol使用，字数很多！！图也很多！！只是感兴趣的同学看一下实验材料板块即可。

有问题欢迎私信交流。

我们需要如下材料：

1. 目标细胞，我们的客户。
2. 带有cas9的载体PX459（用来导入Guide序列,购买链接：http://www.addgene.org/108292/），对于难以转染的细胞通常使用lentiGuide-Puro载体来进行慢病毒包装（购买链接：http://www.addgene.org/52963/），这是我们的剪刀。
3. Guide序列：根据敲除的基因送公司合成（不是直接提取啦！），一般为20个碱基对，敲除的特异性和高效性已经脱靶效应取决于此，这是我们剪刀长的眼睛。
4. 转染的药物：polyjet或者lipo2000,PEI等，这是将剪刀送到细胞里面的顺丰快递。
5. 筛选的药物：嘌呤霉素（puromycin)用来筛选成功转染载体的细胞，这是检查快递送的售后小哥。

一句话概括就送个快递的事~送进去之后该系统就会自动启动了，而且基因剪刀会整合到基因组上，意思就是一旦敲除成功那么这个细胞的子孙后代都完蛋了，保存就冻存该细胞就行。

敲除成功的细胞测序结果为两个等位基因都在PAM区前三个位点发生了碱基为非3倍数的缺失或者增加。

我们需要如下软件：

1. UCSC: http://genome.ucsc.edu，用于下载目标基因的全序列

2.设计guide的网站：来自张锋老师的网站：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

3.使用的载体为pX459V2.0-eSpCas9(1.1)，可以在addgen官网直接购买

（http://www.addgene.org/108292/）。

详细步骤如下：

1.这是px459的图谱，65美元，你先买一个。

这是一个一体化的设计：将识别切割位点的前导序列gRNA和具有切割功能的序列Cas9连接到一个载体上，使用时只需要将该载体转导到细胞内部即可。

2.接下来介绍如何针对你的需求来设计gRNA并连接到这个载体上。

首先打开guide设计的网页：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html（感谢zhang feng lab提供的无偿使用权）

3. 获得了需要的寡核苷酸片段按照分数从高到低排列，这里给出的核酸序列在第二列包含20个碱基加上NGG，我们需要把这20个核苷酸以及它的方向互补序列送去合成并加到之前提到的PX459序列上。这里的设计已经把特异性高效性和基因可靠性都考虑了。我们只需要复制粘贴即可。

4. 为了将这20个核酸插入PX459载体，我们需要借助一个限制性内切酶BBSI把载体切出一个小口子，并包含两个粘性末端。

然后将我们设计的的20个核酸两侧添加上互补的粘性末端。值得注意的是，PAM区也有可能出现在反向序列，这时设计gRNA就要反向添加粘性末端。

5. 经历一系列分子克隆的常规操作：酶切，连接，转化，涂板，挑菌，抽质粒，送测序，测序成功。至此我们已经把所需要的载体都构建完成了，接下来我们将该载体递送到所要敲出的细胞中，常用的方法包括脂质体递送，电转，或者显微注射。比较经济的方法就是转染，利用转染试剂将质粒运进细胞内。6孔板的细胞，大约500ng质粒足够。

6. 运进细胞后，前导序列识别基因组上的PAM区（NGG），并且连接到基因组上，CAS9开始工作并切割。

7. 转染后48小时，更换含有puromycin（嘌呤霉素）的培养基，筛选转染成功并表达该质粒的细胞，因为载体上带有嘌呤霉素抗性，所以只有转染成功的细胞可存活。筛选浓度根据不同的细胞进行调整。

8. 筛选完毕以后，手动或者流式分选将单个细胞分选到96孔板中，静置2周或者3周等待单克隆细胞长成单群落。然后挑选初筛检查被敲除的蛋白是否表达，进一步挑选单克隆细胞进行测序。如果是进行基因敲减实验，直接用第6步最终筛选的pool细胞做实验也可。单克隆筛选是为了获得突变均一的细胞系。

9. 由于Cas9技术只管切不管修，所以修复过程在不同的细胞是不一样的，测序结果也千差万别，我们认为敲除成功的细胞测序结果为两个等位基因都在PAM区前三个位点发生了碱基为非3倍数的缺失或者增加。

该实验成本很低但是效率很高，这也是该技术能够迅速在各个实验室得到广泛利用的全部理由，只需要送合成sgRNA这里需要花钱，20个碱基也就是几块钱，其余的包括细胞培养，筛选，测序全套下来还是非常经济的。

我自己做的一般96孔板一块板子可以挑选出来60%的单细胞（我们实验室手动分选可能会细胞间污染），最后测序成功被证明为可以继续使用的细胞也在10%以上。

参考

1. ^1 https://doi.org/10.1038/nprot.2013.143
2. ^2 https://doi.org/10.1126/science.1247005
3. ^3 https://www.nature.com/articles/nmeth.3047
4. ^4 https://science.sciencemag.org/content/343/6166/84