为什么细菌自己的DNA不会被自己的cas9切断？ 第1页

这个问题还不错。

确实有很多从事CRISPR研究的人不太注意得到这方面的机制，因为现在所谓做CRISPR大多数都在搞工程化应用，对CRISPR作为免疫系统的机制研究不太关注。

已经记录到CRISPR阵列的gRNA序列为什么不会攻击CRISPR阵列自身就不细说了，对II型CRISPR系统而言主要是因为CRISPR阵列上没有PAM。那其实真正的问题是CRISPR系统为什么不会从自己基因组上截取protospacers放到CRISPR阵列里。“Cas1/2依赖于PAM来确定是不是外源DNA”这句话是不准确或者说不对的。

其实个问题有点儿意思的原因在于，这关系到CRISPR与细菌其它防御系统之间的合作问题。目前的模型是CRISPR与RecBCD系统合作进行敌我识别。

首先，细菌采集“原间隔片段”（不知道protospacers这么翻译好不好）的这个步骤叫做“CRISPR适应”。在自然条件下，是有一定概率从自己基因组上采集原间隔片段的，只是这个概率没有高到整个种群活不下去的程度。另外需要注意，CRISPR阵列中出现染色体上的序列，不等于这个序列来自染色体，比如发现一些mobile genetic element的同源序列，有可能是这些序列整合到染色体上之前就被CRISPR系统记录了。

不是所有的CRISPR系统都依赖PAM。题主问的最经典的II型CRISPR系统确实是PAM依赖型（包括采集原间隔片段），因此PAM一定程度上扮演了防止自免疫的角色，但显然不是一种广泛发挥作用的机制，甚至在CRISPR适应这一步不是主要起作用的机制。

PAM并不是CRISPR系统识别敌我的全部，Cas1/Cas2复合体采集原间隔片段的机制非常复杂，一项Nature上发表的研究：Levy, A., Goren, M., Yosef, I.et al. CRISPR adaptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA.Nature 520,505–510 (2015) 第一次建立了一种说得通的模型来解答原间隔序列采集的“敌我”偏好性问题。

这篇文章讲了一件事，作者在E. coli 里发现，Cas1/Cas2对原间隔片段的采集依赖于DNA双链断裂和降解，Cas1/2复合体从RecBCD（大肠杆菌另外一种免疫机制，同时是自身染色体DNA同源重组修复机制的一部分）降解双链DNA末端的中间产物中获取原间隔片段。现在我们知道其中RecBCD发挥的解旋作用是必要的，降解作用则可能可以被其它机制弥补。

很多噬菌体的DNA本身就是线性的，有暴露的双链DNA末端，所以容易在RecBCD降解它的过程中被Cas1/2复合体截取原间隔片段。

外源质粒因为复制频率高，有大量复制叉，而DNA复制时容易出现双链断裂，所以也很容易被CRISPR系统截取。

而细菌基因组正常情况下没有大量暴露的双链DNA末端，在复制过程中出现双链DNA断裂时，也有一定机会被CRISPR系统截取，但是概率小得多。

另外，RecBCD在降解线性DNA时，本身也有敌我识别机制，这种机制被CRISPR系统利用了。

DNA上有一种特征序列叫做Chi序列，这种序列简单说可以看成是RecBCD处理DNA方式的一个切换信号，可以把RecBCD的功能从降解DNA转变为DNA修复，同时也是细菌用来保护自己的。在细菌染色体上，大量存在Chi序列，可以指示RecBCD停止消化自己的染色体，进而将双链DNA断裂修复，这样也就等于阻止了CRISPR系统截取染色体上的DNA片段。而外源DNA很少有Chi序列，于是在被RecBCD降解的过程中就为CRISPR系统截取原间隔片段提供了大量原料。

最后，凡事都有例外，有些细菌是没有RecBCD系统的，有可能是Cas4客串了类似的角色，不过Cas4的主要职责现在来看还是确保protospacer和PAM的关联。

还有一个有趣的问题是Cas9本身扮演的角色，在II型CRISPR系统中，Cas9也参与了原间隔片段的截取，而且会影响DNA截取对象的偏好。这个机制目前不清楚，猜测是Cas9非特异性的DNA内切酶活性在Cas9过表达时可能会制造额外的DNA双链断裂。