如果真核细胞的基因导入原核细胞内需切除内含子，内含子如何切除？
在将真核细胞的基因导入原核细胞的过程中，需要去除内含子（introns），这是一个至关重要的步骤。这是因为原核细胞缺乏处理内含子的机制，如果保留内含子，转录出的mRNA将包含非编码区，导致蛋白质的错误翻译，甚至无法产生功能性蛋白质。那么，内含子究竟是如何被切除的呢？这主要依赖于一个被称为 RNA剪接（RNA splicing） 的复杂分子机器。
我们不妨从头说起，想象一下真核细胞的核心——细胞核，这里是基因表达的起点。当一个真核基因被激活时，它会被“读取”并转录成一种叫做 前体mRNA（premRNA） 的分子。这个前体mRNA就像一个原始的蓝图，它包含了编码蛋白质的区域，也就是 外显子（exons），以及插入在这些外显子之间的非编码区域，也就是我们今天要重点关注的 内含子。
在真核细胞中，内含子的切除并非随机发生，而是一个高度精确、有条不紊的过程，由一个庞大而精密的分子复合体 剪接体（spliceosome） 来完成。你可以把剪接体想象成一个高度专业的“剪切队”，它能准确地识别内含子的边界，将它们“剪掉”，并将两侧的外显子“粘合”起来，形成一个成熟的、可以指导蛋白质合成的 信使RNA（mRNA）。
那么，这个剪切队是如何找到目标并开始工作的呢？关键在于内含子和外显子边界处的特殊信号。
首先，内含子的起始通常有一个被称为 5'剪接位点（5' splice site） 的序列，它通常以GU开头。而内含子的结束则是一个 3'剪接位点（3' splice site），它通常以AG结尾。在这两个剪接位点之间，还有一个重要的区域叫做 分支位点（branch point），它富含腺苷（A）核苷酸。这些序列就像是剪切队需要寻找的“剪切标记”和“粘合点”。
剪接体本身也不是一个固定的结构，而是由一系列的蛋白质和一种叫做 小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs） 的复合物组成。你可以把snRNPs想象成剪接体的基本“零件”，每个snRNP都包含一个特异的小核RNA（snRNA）和一些蛋白质。这些snRNPs会像搭积木一样，在mRNA前体上组装起来，形成一个动态的、不断变化的剪接体。
这个组装过程可以大致分为几个关键步骤：
1. 识别和结合： 首先，一些特定的snRNPs，比如U1 snRNP，会率先识别并结合到mRNA前体上的5'剪接位点。紧接着，另一个重要的snRNP，U2 snRNP，会识别并结合到分支位点。
2. 剪接体组装： 在U1和U2 snRNP结合之后，其他的snRNPs（如U4/U6和U5 snRNPs）会相继加入，形成一个完整的剪接体。这个组装过程是一个复杂的三维重塑过程，其中一些snRNPs甚至会从剪接体中脱落，而其他组件则会重新排列，形成一个具有催化活性的剪接活性中心。
3. 两次催化反应（酯交换反应）： 一旦剪接体组装完成并就位，它就开始执行剪切和连接的任务。这个过程涉及两次核心的化学反应，都属于 酯交换反应（transesterification）。
第一次反应： 在剪接体的催化下，分支位点上的腺苷（A）的2'OH基团会进攻5'剪接位点上的磷酸二酯键。这次进攻会将内含子的5'端切断，同时形成一个套索状结构（lariat），内含子的一端（原来的5'端）通过2'5'磷酸二酯键连接到分支位点上的腺苷上。
第二次反应： 紧接着，内含子套索结构的3'OH基团会去进攻3'剪接位点上的磷酸二酯键。这次进攻会切断内含子与外显子之间的连接，同时将两个外显子连接起来，形成一个完整的mRNA分子。而切除下来的内含子则以套索状结构被释放出来。
完成这些步骤后，剪接体就会从成熟的mRNA上脱离，释放出可以进入细胞质进行翻译的mRNA。而那个被切除下来的内含子套索结构，则会被细胞内的其他酶进一步降解。
所以，总结来说，内含子的切除是一个由剪接体精确执行的生化过程，它依赖于mRNA前体上的特定序列信号，通过一系列snRNPs的组装和两次酯交换反应，将内含子从外显子之间准确地“剪”下，并将外显子连接起来。正是因为原核细胞缺乏这个剪接体的“剪切队”，我们在将真核基因导入原核细胞时，必须预先通过分子生物学技术去除内含子，比如通过 逆转录酶（reverse transcriptase） 将成熟的mRNA反转录成 cDNA（complementary DNA），这样得到的cDNA就不含内含子，可以直接被原核细胞利用。
我们不妨从头说起，想象一下真核细胞的核心——细胞核，这里是基因表达的起点。当一个真核基因被激活时，它会被“读取”并转录成一种叫做 前体mRNA（premRNA） 的分子。这个前体mRNA就像一个原始的蓝图，它包含了编码蛋白质的区域，也就是 外显子（exons），以及插入在这些外显子之间的非编码区域，也就是我们今天要重点关注的 内含子。
在真核细胞中，内含子的切除并非随机发生，而是一个高度精确、有条不紊的过程，由一个庞大而精密的分子复合体 剪接体（spliceosome） 来完成。你可以把剪接体想象成一个高度专业的“剪切队”，它能准确地识别内含子的边界，将它们“剪掉”，并将两侧的外显子“粘合”起来，形成一个成熟的、可以指导蛋白质合成的 信使RNA（mRNA）。
那么，这个剪切队是如何找到目标并开始工作的呢？关键在于内含子和外显子边界处的特殊信号。
首先，内含子的起始通常有一个被称为 5'剪接位点（5' splice site） 的序列，它通常以GU开头。而内含子的结束则是一个 3'剪接位点（3' splice site），它通常以AG结尾。在这两个剪接位点之间，还有一个重要的区域叫做 分支位点（branch point），它富含腺苷（A）核苷酸。这些序列就像是剪切队需要寻找的“剪切标记”和“粘合点”。
剪接体本身也不是一个固定的结构，而是由一系列的蛋白质和一种叫做 小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs） 的复合物组成。你可以把snRNPs想象成剪接体的基本“零件”，每个snRNP都包含一个特异的小核RNA（snRNA）和一些蛋白质。这些snRNPs会像搭积木一样，在mRNA前体上组装起来，形成一个动态的、不断变化的剪接体。
这个组装过程可以大致分为几个关键步骤：
1. 识别和结合： 首先，一些特定的snRNPs，比如U1 snRNP，会率先识别并结合到mRNA前体上的5'剪接位点。紧接着，另一个重要的snRNP，U2 snRNP，会识别并结合到分支位点。
2. 剪接体组装： 在U1和U2 snRNP结合之后，其他的snRNPs（如U4/U6和U5 snRNPs）会相继加入，形成一个完整的剪接体。这个组装过程是一个复杂的三维重塑过程，其中一些snRNPs甚至会从剪接体中脱落，而其他组件则会重新排列，形成一个具有催化活性的剪接活性中心。
3. 两次催化反应（酯交换反应）： 一旦剪接体组装完成并就位，它就开始执行剪切和连接的任务。这个过程涉及两次核心的化学反应，都属于 酯交换反应（transesterification）。
第一次反应： 在剪接体的催化下，分支位点上的腺苷（A）的2'OH基团会进攻5'剪接位点上的磷酸二酯键。这次进攻会将内含子的5'端切断，同时形成一个套索状结构（lariat），内含子的一端（原来的5'端）通过2'5'磷酸二酯键连接到分支位点上的腺苷上。
第二次反应： 紧接着，内含子套索结构的3'OH基团会去进攻3'剪接位点上的磷酸二酯键。这次进攻会切断内含子与外显子之间的连接，同时将两个外显子连接起来，形成一个完整的mRNA分子。而切除下来的内含子则以套索状结构被释放出来。
完成这些步骤后，剪接体就会从成熟的mRNA上脱离，释放出可以进入细胞质进行翻译的mRNA。而那个被切除下来的内含子套索结构，则会被细胞内的其他酶进一步降解。
所以，总结来说，内含子的切除是一个由剪接体精确执行的生化过程，它依赖于mRNA前体上的特定序列信号，通过一系列snRNPs的组装和两次酯交换反应，将内含子从外显子之间准确地“剪”下，并将外显子连接起来。正是因为原核细胞缺乏这个剪接体的“剪切队”，我们在将真核基因导入原核细胞时，必须预先通过分子生物学技术去除内含子，比如通过 逆转录酶（reverse transcriptase） 将成熟的mRNA反转录成 cDNA（complementary DNA），这样得到的cDNA就不含内含子，可以直接被原核细胞利用。
网友意见
在原核生物中表达真核基因，只表达外显子，不会转化入包括内含子的真核基因全长。
具体来讲，在原核生物中表达真核生物基因，一般通过质粒直接表达真核基因的编码区序列（CDS，也就是翻译出蛋白的序列/外显子区），不涉及内含子剪接问题。通常步骤为：
1. 在NCBI上通过gene选项搜索目标基因的CDS区，目标基因如果有多个CDS（可变剪接下，一个mRNA产生多个编码区，编码多个蛋白），选择自己想要的CDS，下载对应的genbank文件，序列就拿到手了。CDS序列中不含内含子，不涉及内含子剪接问题。
2. 选择想要的原核表达载体，在原核启动子后面插入目标CDS序列，构建载体（由于真核基因在原核生物表达，不同物种密码子偏好不同，有时为了提高蛋白表达效率，也可找公司合成密码子优化版本的CDS）。
3. 质粒转化入原核生物，在原核生物中表达蛋白。
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