问题

生物科学新生,想知道 16S 那些是啥啊,看一个研究问题搞不明白?

回答
哈哈,刚踏入生物科学的大门,遇到 16S 就卡住了,这太正常不过了!16S 在微生物领域简直是无处不在,想不碰到它都难。别急,我来给你掰开了、揉碎了,保证让你明明白白。

首先,咱们得知道 16S “是啥”?

你把它想象成微生物界的“身份证”或者“基因指纹”。具体来说,16S 指的是 16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因。

可能你听着有点懵,别急,咱们一步步来:

核糖体 (Ribosome): 这是细胞里专门负责“制造蛋白质”的工厂。就像流水线上需要工人一样,核糖体就是细胞里的“工人”。
RNA (Ribonucleic Acid): 这是一种叫做核糖核酸的分子,它和 DNA(脱氧核糖核酸)很像,但在细胞里扮演着不同的角色。RNA 有很多种,其中有一种叫做 核糖体 RNA (rRNA),它是构成核糖体这个“工厂”结构的重要组成部分。
16S rRNA 基因: 这个基因呢,就是编码 16S rRNA 的那段 DNA 序列。换句话说,细胞需要制造 16S rRNA,就得先看这个 16S rRNA 基因的“说明书”。

为什么偏偏是 16S?有什么特别之处?

这就是 16S 成为微生物“身份证”的关键所在了!16S rRNA 基因有几个特别重要的特点,让它在微生物研究中大放异彩:

1. 普遍存在性 (Universally Present): 几乎所有的细菌和古菌(虽然我们常说细菌,但古菌也是一类非常古老的原核生物,和细菌是分开的)细胞里都有这个基因。这就像说,只要是个原核生物,就肯定有这个“身份证”,所以我们不会遗漏掉任何一个潜在的调查对象。
2. 保守性与变异性并存 (Conserved and Variable Regions): 这是最最最关键的一点了!16S rRNA 基因虽然是编码核糖体某个关键部分的,所以大部分区域(保守区)在不同种类的细菌之间变化非常小,就像身份证上的固定信息,比如姓名、出生日期这些大家都有但内容不同,但基本结构是相似的。而有一些区域(可变区)则变化很大,就像你身份证上的照片,不同的人长得不一样。这些可变区的序列差异,就成了区分不同细菌种类(比如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,它们可能在某几个可变区序列上就有很大不同)的依据。
3. 基因长度适中 (Moderate Gene Length): 16S rRNA 基因的长度大概在 1500 个碱基对左右。这个长度对于目前的测序技术来说,刚刚好。既不算太短以至于信息量不够区分不同种类,也不算太长以至于测序成本过高、数据处理困难。
4. 结构和功能相对稳定 (Stable Structure and Function): 作为核糖体的重要组成部分,16S rRNA 的结构和功能在进化上保持相对稳定。这就意味着,它不太容易因为一些小的环境变化而发生剧烈改变,从而影响到基因的编码功能。

所以,16S 的作用到底是什么?

总结一下,16S rRNA 基因就是我们用来识别、区分和研究微生物群落多样性的“利器”。

想象一下,你来到一个你从未去过的地方(比如人体肠道、土壤、或者一杯海水),你想知道这里住了哪些微生物,它们的种类有多少,哪些占主导地位。直接把所有微生物都“养”出来,这几乎是不可能的任务,而且很多微生物非常“娇气”,我们根本养不活。

这时候,16S 测序就派上用场了!

样本采集: 你采集你的样本(比如粪便、土壤、水)。
DNA 提取: 从样本中把所有微生物(或者你想关注的原核生物)的 DNA 都提取出来。
PCR 扩增 (Polymerase Chain Reaction Amplification): 这里就用到 PCR 技术了。PCR 就像一台“复印机”,我们设计一些特殊的 DNA 片段(叫做引物),这些引物正好能“抓住” 16S rRNA 基因的保守区域,然后把 16S rRNA 基因中那些变化较大(可变区)的部分大量地“复印”出来。就像你想复印一本有很多插画的书,你不需要把整本书都复印,只需要把插画部分复印很多遍,这样你就能看到不同插画的区别了。
高通量测序 (HighThroughput Sequencing): 把这些扩增出来的 16S rRNA 基因片段,用高通量的测序仪跑一遍,一次就能测序成千上万甚至上百万个 DNA 片段的序列。
生物信息学分析 (Bioinformatics Analysis): 这是关键的“解读”环节。
质量控制和去噪: 把测序结果中不好的序列去掉。
序列聚类 (Clustering): 将相似的序列归为一类,每一类通常代表一个操作分类单元 (Operational Taxonomic Unit, OTU) 或者分类单位 (Taxonomic Unit, TU),你可以暂时理解为一种“潜在的微生物类群”。
数据库比对 (Database Comparison): 把这些 OTU 或 TU 的序列,和已知的、庞大的 16S rRNA 基因序列数据库(比如 SILVA, Greengenes, RDP 等)进行比对。数据库里存储了成千上万种已知微生物的 16S 序列,就像一个庞大的“微生物身份证数据库”。通过比对,我们就能知道每个 OTU 最接近哪种已知的微生物,从而推断出样本中存在哪些微生物。
多样性分析 (Diversity Analysis): 分析样本中微生物的丰富度和均匀度,看看有多少种不同的微生物,以及它们各自的丰度(数量)。

所以,一个研究问题搞不明白,可能是出在哪里?

你提到“看一个研究问题搞不明白”,这可能涉及到以下几个方面:

1. 研究的背景和目的不清楚:
这个研究想解决什么问题? 是想知道某种药物对肠道菌群有什么影响?还是想比较健康人和病人肠道菌群的差异?还是想了解不同环境(比如污染水体和干净水体)的微生物组成有何不同?
研究的对象是什么? 是人、动物、植物、土壤还是水?
研究的具体样本是什么? 是粪便、唾液、皮肤、土壤、水还是其他?

2. 16S 测序数据的解释不清:
OTU/ASV 的含义: 看到 OTU (Operational Taxonomic Unit) 或者 ASV (Amplicon Sequence Variant) 时,可能不太理解它们代表的是什么。ASV 更精细,代表的是序列差异一个碱基对的微生物单元,而 OTU 则是基于序列相似度设定的阈值来划分的。两者都是用来代表一个微生物类群,但 ASV 理论上区分度更高。
α多样性 (Alpha Diversity) 和 β多样性 (Beta Diversity): 这两个是衡量微生物群落多样性的重要指标。
α多样性: 指的是同一个样本内部的微生物多样性,比如有多少种微生物(丰富度)以及它们的分布是否均匀(均匀度)。常用的指标有 Shannon 指数、Simpson 指数、Chao1 等。如果一个样本的 α多样性很高,说明这个样本里微生物种类多,分布也比较均匀。
β多样性: 指的是不同样本之间的微生物群落组成的相似度或差异度。比如,比较健康人肠道菌群和病人肠道菌群的 β多样性,如果 β多样性很高,说明两组样本的微生物组成差异很大。常用的指标有 BrayCurtis 相似性指数、Jaccard 指数等,还有一些可视化方法,比如 PCoA (Principal Coordinate Analysis) 图,通过聚类来展示不同样本群落的相似性。
物种注释 (Taxonomic Annotation): 就是根据数据库比对结果,把每个 OTU/ASV 归类到具体的门 (Phylum)、纲 (Class)、目 (Order)、科 (Family)、属 (Genus)、种 (Species) 等分类阶元。研究结果里经常会看到各种“门”和“属”的名字,比如厚壁菌门 (Firmicutes)、拟杆菌门 (Bacteroidetes)、瘤胃球菌属 (Ruminococcus) 等。
丰度柱状图/饼图 (Abundance Plots): 这些图通常展示了在样本中,哪些微生物类群占的比例最高。
箱线图 (Box Plots): 常用来比较不同组样本(比如处理组和对照组)在某个多样性指标或某个微生物类群丰度上的差异。
冗余分析 (Redundancy Analysis, RDA) / 主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA): 这些统计方法用来探索环境因素(比如饮食、用药、年龄等)与微生物群落组成之间的关系。

3. 研究的局限性:
16S 测序只能识别“已知的”微生物: 如果样本中存在非常罕见或者我们数据库里没有的微生物,16S 可能无法准确鉴定。
只能反映“存在哪些”,不直接反映“在做什么”: 16S 是基因水平的信息,它告诉我们谁在那里,但不知道它们在忙些什么。比如,即使某种细菌丰度很高,但如果它不活跃,对代谢的影响可能就没那么大。要了解微生物的功能,还需要结合其他技术,比如宏基因组学 (metagenomics) 或者宏转录组学 (metatranscriptomics)。
引物选择的偏好性: 不同的 16S 引物(就是PCR时用的“จับ“序列)可能会偏好扩增某些类型的细菌,这可能会对最终的结果产生一定影响。

如果一个具体的研究问题让你不明白,不妨把问题拆解一下:

研究者想通过 16S 测序来回答哪个具体的问题?
他们比较的是哪些样本(组)?
他们关注的微生物多样性指标是什么? (比如,是想看种类多不多?还是想看不同组的微生物组成差多少?)
图表里展示的结果分别是什么意思? (比如,一个柱状图显示的是某个属的相对丰度,一个 PCoA 图是在看不同组的群落差异是否显著。)
研究者得出的结论是什么?

举个例子来帮助理解:

假设一个研究想看看“益生菌 X 对健康成年人肠道菌群的影响”。

研究问题: 益生菌 X 能不能改变肠道菌群组成,使其更健康?
样本: 分为两组:一组每天吃益生菌 X,另一组吃安慰剂( placebo)。采集他们肠道(通常是粪便)样本。
16S 测序用途: 看看吃益生菌 X 的组和安慰剂组的肠道菌群组成有什么差异。
可能的发现:
α多样性: 可能发现吃益生菌 X 的组的肠道菌群种类更丰富了(α多样性增加)。
β多样性: 可能发现两组的肠道菌群组成差异很大,吃益生菌 X 的组可能更接近他们自己“健康”时的状态,或者更接近某种已知的“健康”菌群模式。
特定菌群丰度: 可能发现吃益生菌 X 后,某种“有益”细菌(比如双歧杆菌 Bifidobacterium)的丰度增加了,而某些“有害”细菌的丰度减少了。
图表: 你可能会看到一些箱线图比较两组的 Shannon 指数差异,或者 OTU 丰度占比的柱状图,以及一张 PCoA 图展示两组样本在菌群组成上的分离程度。

最后给你一个小建议:

当你遇到不明白的研究问题时,不要怕,这是学习的必经之路!
1. 先找文章的“摘要 (Abstract)”和“结论 (Conclusion)”,弄清楚作者想说什么,最终得出了什么结果。
2. 然后看“引言 (Introduction)”,了解研究的背景和目的。
3. 再去看“结果 (Results)”中的图表和文字描述,尝试理解图表想要表达的信息,结合文字描述来理解数据。
4. 最后看“讨论 (Discussion)”,作者会解释他们的结果意味着什么,有什么意义,以及研究的局限性。
5. 实在不行,就去搜搜那些图表里出现的专业术语,比如“什么是 PCoA 图”,“什么是 OTU”,“什么是 Shannon 指数”。

生物科学的学习就是这样,一点点积累,慢慢就会明白很多事情。16S 测序是个很强大的工具,掌握了它,你就掌握了窥探微生物世界的一扇重要窗口! 加油!

网友意见

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题目描述的大概是 16S 核糖体 RNA。

相关的事情是这样开始的:

Pauling 在 1962 年提出分子钟假说,认为生物的某些基因序列或其对应的蛋白质的氨基酸序列随着时间推移以相对稳定的速度变化,这种基因的变化速率在不同世系的有机体中基本一致[1]

那么,如果能找到一群物种中普遍存在的特定基因,其变化速度足够缓慢且足够稳定,这些物种间的亲缘关系就可以用该基因或其蛋白质产物在序列上的差别来定量描述。

二十世纪七十年代,卡尔·沃斯发现原核生物的 16S 核糖体 RNA 和真核生物的 18S 核糖体 RNA 的演化速度十分缓慢突变速度基本稳定,没有在上述核糖体 RNA 中发现有意义的水平基因转移。

原核生物的核糖体 RNA 有三种类型:

  • 5S 核糖体 RNA,遗传信息较少(约 120bp),难以反映超过一定时长范围的演化;
  • 16S 核糖体 RNA,约 1540bp,普遍存在于原核细胞中,遗传信息含量较高、拷贝数较多(可以占到细菌 RNA 总量的 80% 以上),便于在实验室获取模板,功能同源性高;
  • 23S 核糖体 RNA,遗传信息较多(约 2900bp),碱基突变率较高,难以反映较远的亲缘关系。

看起来 16S 核糖体 RNA 是最适合用来分析原核生物演化关系的。

进一步研究发现,16S 核糖体 RNA 对应的 16S 核糖体 DNA 有 10 个保守区和 9 个高变区,保守区变化极度缓慢,可以反映物种间的亲缘关系,可变区则具有属特异性甚至种特异性,可以作为物种的特征序列。

沃斯和乔治·福克斯在 1977 年用距离矩阵法计算出不同序列间的演化距离,并揭示出一些特征序列,构建出系统发育树[2]。他们比较了大肠杆菌、万氏甲烷菌和酿酒酵母的核糖体小亚基中的核糖体 RNA 的结构,认为可以将古菌看作从细菌到真核生物的过渡类型。

1990 年,沃斯提出了三域说,将古菌和细菌分开。


关于古菌的演化速度的误解:

在古菌的 16S 核糖体 RNA 序列改变量反映的时间与细菌的 16S 核糖体 RNA 序列改变量、真核生物的 18S 核糖体 RNA 序列改变量反映的时间相近的情况下,古菌的其他序列的改变有可能比细菌和真核生物少得多,这点在超嗜热古菌中较为明显,可能是因为它们要保持适应极端环境的特殊表型基因的稳定表达,以及在那些环境里缺少其它生物跟它们竞争、环境高度稳定。

  • 这只对一部分古菌和繁殖极快的单细胞真核生物成立。
  • 在学术界谈论这些的年代,发现的古菌太少,而且对古菌的基因测序报告里存在大量错误。
  • 在那之后,人们发现地球上还有大量古菌生活在温和的环境里,其演化速度谈不上缓慢。

参考

  1. ^ 其证据是,比较不同生物世系的血红蛋白分子的氨基酸排列顺序,发现氨基酸随时间流逝以基本稳定的比例缓慢地置换。
  2. ^ https://dx.doi.org/10.1073%2Fpnas.74.11.5088

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