如何看待韩春雨诚邀相关领域的质疑学者前来实验室，探讨实验问题？ 第1页

超过一百赞啦，我决定抽出搬砖的时间写的更详细一点吧。

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哪个大牛教授是傻逼吗？去河北科大跟他论剑。人家难道没有自己的课题项目要做，难道不是每天都很忙嘛？为了一个莫须有的东西浪费时间是很愚蠢的行为。

他来北大讲座时候跟他谈好的合作，我本人在他发大文章不久就去河北找他商量合作事宜，顺便参观了一下实验室，那时候还没出事，举国欢庆屌丝科学家不急功近利甘坐冷板凳终逆袭。跟他扯了一个下午，都在瞎扯淡，没有获得任何有用的信息，合作也没有展开。当时要合作的一个课题是用ago做活细胞染色质标记，这个要求很高，如果效率稍微低点，就不能标记（比如Cas9可以，而cpf1不可以）。而韩闪烁其辞，不太想跟我们合作这个。当时没觉得有问题，现在想下，他肯定知道这个实验没法成功所以啥也不说！

我一个苦逼学生，尚且觉得去他们实验室算是我人生的一个耻辱，你觉得哪个大牛教授还愿意去河北科大他的实验室找他，跟他喝茶听他弹古琴吗？（不能地图炮）

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答主北大BIOPIC在读博士砖工，主要方向为活细胞染色质标记方法开发和动态研究。

研究细胞中染色体及基因的位置信息对理解基因表达调控有着重要意义，要研究清楚基因在细胞核内的空间位置与其功能性输出的关系，需对细胞内特异的基因位点进行标记以获得空间信息。同时还要获得基因表达过程中的基因位置的动态信息，所以发展活细胞染色质DNA的荧光标记技术和方法对解决基因组结构和功能的关系非常重要。

常见的传统标记方法包括：荧光原位杂交（FISH）1，荧光核苷酸类似物2，标记常见DNA结合蛋白3，荧光阻遏蛋白操纵子系统（FROS）4，可编辑人工核酸酶标记系统等5,6。

最近五年来，基因组靶向编辑技术的快速发展，使得围绕可编辑的DNA结合蛋白的相关外围技术也得到快速的开发与应用，主要用于基因表达调控和成像研究。TALE(transcription activator-like effector)和CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9)技术的出现为活细胞染色质DNA的标记打开了一扇新的大门。因为可以识别并结合特异DNA片段并且可以在细胞内持续表达，所以TALE和CRISPR都可以用来标记活细胞染色质DNA。

TALE系统所存在的问题：虽然TALE系统因为荧光蛋白直接融合在TALE蛋白上，因此多位点标记只需对不同位点设计相应的TALE并融合不同颜色的荧光蛋白就可以实现，但是TALE的模块化组装过程仍比较繁琐，通量很低，只能设计组装数量有限的TALE。针对非重复序列而言，增强信号需要针对靶序列设计多条TALE，这几乎是不可行的。(放弃)

CRISPR系统所存在的问题，现有的基于一种Cas9标记技术不能做多色同时成像。因为其特异性是由sgRNA决定的，而荧光蛋白是融合在dCas9上，因此做多色同时标记很困难。虽然近期Ma等人用正交CRISPR系统实现了双色标记，但多色非重复单基因位点标记需要同时导入的sgRNA数量更多，因此目前CRISPR多色标记上只实现了在重复序列的标记，非重复序列的标记尚未开发成功。另外，NM Cas9和ST1 Cas9对PAM位点的要求要比常用的SP Cas9苛刻，在较小的DNA长度范围内不易找到足够数量的PAM位点，可设计的sgRNA数量有限。而且NM Cas9和ST1 Cas9的PAM序列简并性较强，很容易出现脱靶效应。这些给非重复单基因位点标记时sgRNA的选取带来不便。

有鉴于此，答主根据晶体结构改造针对sgRNA与Cas9形成的复合物中伸出Cas9外面的sgRNA进行，连上可以和某些外源蛋白结合的RNA适配子，如MS2，PP7，Spinach等。将这些适配子的结合蛋白融合上荧光蛋白即可标记sgRNA识别的靶序列,开发了基于改造sgRNA的活细胞染色质标记方法，相关文章已经发表在NAR上7，并且后续有四五篇类似的文章跟进，都是同一时期的工作8-11，答主稍微快了一点，有一篇比我稍早一点（蜜汁微笑脸）。

但是用用CRISPR一直难以标记非重复序列，主要原因在于多条sgRNA难以共转染。如果用极短的ssDNA，我推测可以共转一个混合的ssGuide的库（鸡尾酒办法）。所以当韩春雨的文章发表以后，我们非常激动，他5月2号online,我五月五号才知道，立即着手跟他联系。然而未得回应。然后我就没有等他，直接去微生物所购买的菌株，同时合成密码子人缘化的Ago,跟TtAgo做序列对比，找出潜在的活性位点，看很多背景文献，想做一个内切酶失活的dNgAgo，只binding DNA而不切割。现在看来，这玩意本来就没有活性，我TMD真是想太多！顺便说一下，出事以前我一直很佩服他，朋友圈很多关于他的我现在还没删。

韩春雨老师在我们实验室（禁止转载）

韩春雨老师在北大的报告海报

我在河北科大韩春雨老师实验室（禁止转载）

后面北大的魏文胜老师邀请他来作报告，他还真来了，报告场面非常火爆，整个附近的学校感兴趣的人都来听，早去半个小时，都没位置了。我听了一场报告，虽然他没讲文章，PPT看上去low lowe的，中文的，还有错别字，但是感觉这人很厉害，特有insight（科学问题之外），对于很多明显是为难他的问题（校外人员所问，非北大师生，我们对他一直很友好），比较敏感，比如经费，基金号啥的，他都回答的非常得体，滴水不漏。报告的下午，是他和北大PI的面谈会，每个PI只有半个小时，一下午大概有十几个人跟他单独meeting，超时都不行。。。。。。我很有幸，跟着我们老板跟他谈了半个小时。当时他说时间有限，你要真想合作，你来我们河北科大，我们再细谈。后面过了几天，我就直接去了河大科大，然后跟他谈了一下午，喝了一下午茶（感谢），主要在听他吹牛。跟NBT的一作高峰吃了两顿饭，未获得任何内部消息，我获得所有的信息跟大家一样，都来自那篇NBT文章。对于这个用Ago做活细胞标记的课题，他们不太想合作，提出合作一个新的课题，当然新课题后面我做了一段时间以后效果不理想我不感兴趣也流产了，具体是什么课题出于科研道德需要保密，我没有继续做，他们可能还在做。

用Ago做活细胞标记的合作没有展开，然后我回来就自己做，然后就是各种失败，跟大家一样，我也做了内源基因切割，质粒切割等等试验，全是Negative Results,在此不再赘述。

我想从另一个角度来说明一下这个问题，利用成像的办法可以检测这个蛋白是否结合DNA。人的细胞内的端粒是有很多的六碱基的重复TTAGGG，重复好几千次。因此设计针对端粒的ssDNA ,如果Ago可以结合DNA，在细胞内就能看到很多亮点的聚集，像Cas9一样，然而，Ago的test结果是negative，荧光蛋白呈弥散状态。而Cas9可以聚集形成亮点。这不能严格说明Ago完全不结合DNA，至少可以说明结合能力非常非常弱，达不到可以使用光学方法检测的下限。其实光学的检测非常灵敏，出于严密性，但是我不能把结论下的太死，说它完全不结合。更严格的实验应该使用dAgo,.可能有人会argue我使用的Ago将Telomere切碎啦，所以看不见聚集点。但大家都没有检测到Ago的切割活性，我要是能把所有的Teloemres都切碎我也就神了，所以使用Ago也是一样的O(∩_∩)O哈哈。~。这个结果我们已经给NBT的editor致信啦。就是最近很多人都在把自己的结果整理（有个大牛在负责整理， we are one of them），写信给editor,我相信很快就会有一篇针对韩文章的NBT corresponding letter出来，大家严密关注NBT官网拭目以待。

利用dCas9和Ago标记细胞内的端粒DNA效果图（禁止转载）

Telomere labeling and imaging by dCas9 and NgAgo in living human cells

(A). sgRNA and gDNA design diagram for telomere imaging. Telomeres, specialized structures which localize at both ends of each chromosome, consist of multiple ‘TTAGGG’ repeats of a short tract about 5 to 15 kb. Such repeats allow the recruitment of multiple fluorescent proteins fused dCas9 or NgAgo molecules to the same locus using a single sgRNA or gDNA sequence, which render a direct readout for detection of whether aCas9 or NgAgo can bind DNA. Successful binding can generate fluorescent puncta while no interaction between proteins and DNA will result in a diffusive distribution of the fluorescent proteins. Green lines represent the sgRNA binding sites and red lines indicate the gDNA binding sites.

(B). Telomere labeling by CRISPR imaging system. In order to increase the nuclear importing efficiency of the dCas9 protein, two nuclear localization sequences (NLS) were added to both the N- and C- termini. NLS-dCas9-NLS was fused with EGFP. Human breast cancer cell line MDA-MB-231was transfected with 1 ug dCas9-EGFP plasmid and 1ug sgRNA plasmid targeting telomeres. 24h post transfection, live cell imaging was implemented using a Nikon TiE inverted microscope equipped with a 100X oil objective. Multiple fluorescent puncta were visualized in the nucleus, suggesting that most dCas9 proteins bind telomeres in the presence of sgRNA. White line indicated the boundary of the cell nucleus. Scale bar, 5μm.

(C). Telomere labeling by NgAgo imaging system. In order to increase the nuclear importing efficiency of the NgAgo protein, two nuclear localization sequences (NLS) were added to both the N- and C- termini. NLS-NgAgo-NLS was fused with super fold Cherry (sfCherry). Cells were transfected with 1ug NgAgo-sfCherry (or sfCherry-NgAgo) plasmid and 1ug gDNA (5’ phosphorylated by commercial synthesis, T4 PNK or without phosphorylation) targeting telomeres. 24h post transfection, live cell imaging was carried out with the same condition as used in CRISPR imaging. In all six scenarios, NgAgo showed diffusive distribution in the nucleus. The labeling failure indicates that NgAgo is unable to bind genome DNA or interact with DNA with an extremely low affinity beyond the detection threshold of live cell imaging assay. White line indicated the boundary of the cell nucleus. N: Nucleus, C: cytoplasm, Scale bar, 5μm.

至于他邀请业内专家去找他一起解决问题，我只能说呵呵，本宝宝不玩了。但是本宝宝被你玩了，需要使用科学的方法解决这个问题。

参考文献：

1 Tagarro, I., Fernández-Peralta, A. M. & González-Aguilera, J. J. Chromosomal localization of human satellites 2 and 3 by a FISH method using oligonucleotides as probes. Hum. Genet.93, 383-388 (1994).

2 Jackson, D. A., Hassan, A. B., Errington, R. J. & Cook, P. R. Visualization of focal sites of transcription within human nuclei. EMBO J.12, 1059-1065 (1993).

3 Kanda, T., Sullivan, K. F. & Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol.8, 377-385 (1998).

4 Robinett, C. C. et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol.135, 1685-1700 (1996).

5 Miyanari, Y., Ziegler-Birling, C. & Torres-Padilla, M. E. Live visualization of chromatin dynamics with fluorescent TALEs. Nat. Struct. Mol. Biol.20, 1321-1324, doi:10.1038/nsmb.2680 (2013).

6 Chen, B. et al. Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. Cell155, 1479-1491, doi:10.1016/j.cell.2013.12.001 (2013).

7 Shao, S. et al. Long-term dual-color tracking of genomic loci by modified sgRNAs of the CRISPR/Cas9 system. Nucleic Acids Res., doi:10.1093/nar/gkw066 (2016).

8 Wang, S., Su, J. H., Zhang, F. & Zhuang, X. An RNA-aptamer-based two-color CRISPR labeling system. Scientific reports6, 26857, doi:10.1038/srep26857 (2016).

9 Cheng, A. W. et al. Casilio: a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid for gene regulation and genomic labeling. Cell Res., doi:10.1038/cr.2016.3 (2016).

10 Ma, H. et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat. Biotechnol., doi:10.1038/nbt.3526 (2016).

11 Fu, Y. et al. CRISPR-dCas9 and sgRNA scaffolds enable dual-colour live imaging of satellite sequences and repeat-enriched individual loci. Nat Commun7, 11707, doi:10.1038/ncomms11707 (2016).