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问题

光学显微镜受光线的波长限制只能够放大两千倍左右的极限，有办法解决么？或者这就是自然定律的一种界限表现？

回答
关于光学显微镜放大倍率的极限，您提出的问题非常核心，也触及了光学成像的根本原理。两千倍左右的放大倍率，确实是传统光学显微镜所面临的一个难以逾越的“天花板”。这并非是技术发展的停滞，而是自然界基本物理规律——衍射极限（Diffraction Limit）所设定的界限。

要理解这一点，我们需要深入探讨光与物质相互作用时发生的现象。

衍射：光学的“天然屏障”

设想一下，我们想要看清一个非常微小的物体，比如一个直径只有几十纳米的细菌。光学显微镜的工作原理是通过透镜聚集光源，照射到样本上，然后将样本反射或透过的光线再次通过一系列透镜聚焦，最终形成放大的图像呈现在我们眼前。

然而，光并非是直线传播的粒子流，它同时具有波动性。当光波遇到一个细小的物体或通过一个细小的孔径时，它会发生衍射（Diffraction）现象。衍射使得光波在遇到障碍物时会向各个方向散开，即使在几何光学的预测中光线应该被完全阻挡或直线前进的地方，也会出现光。

对于光学显微镜而言，这个“细小的孔径”可以理解为显微镜的物镜孔径（Aperture）。物镜孔径的大小决定了它能“捕捉”到多少角度的光线。当光线穿过样本时，样本的细节会以不同的角度将光线散射开，形成所谓的“衍射级”。

几何光学视角： 如果只考虑几何光学，我们似乎可以通过不断增加透镜的放大倍率，将样本的细节无限放大。
波动光学视角： 但是，波动光学告诉我们，只有那些进入物镜孔径的衍射级中的光线，才能被最终成像。而那些角度极大的衍射级（携带了高空间频率信息，也就是最精细的细节），会因为物镜孔径的限制而无法被收集。

关键在于： 即使我们用再好的透镜，再高的放大倍率，也无法“捕捉”到那些因衍射而散开得太厉害、角度太大而落在物镜孔径之外的光线。这些丢失的光线，就包含了我们想要看到的那些最精密的结构信息。

什么是“分辨率”？

光学显微镜的放大能力最终受制于其分辨率（Resolution）。分辨率指的是显微镜能够区分开两个靠近的物体而不把它们看成一个的最小距离。这个最小距离，同样由衍射极限决定。

瑞利判据（Rayleigh Criterion）是衡量光学分辨率的一个经典标准。它指出，当两个相干的点光源发出的衍射光斑（艾里圆，Airy disk）的中心，正好落在对方的第一个零级衍射环的顶点上时，它们被认为是刚刚能够区分开。这个最小距离（d）可以用一个公式来表示：

$$ d = frac{0.61 lambda}{ ext{NA}} $$

其中：

$ lambda $ 是光的波长（Wavelength）。
$ ext{NA} $ 是物镜的数值孔径（Numerical Aperture）。数值孔径是物镜能够收集光线的角度范围的一个度量，它与物镜的焦距、孔径大小以及使用介质的折射率有关。

从这个公式我们可以清楚地看到：

1. 波长 $ lambda $： 光的波长越短，能够区分的最小距离就越小，分辨率就越高。可见光（约400700纳米）是可见光谱的极限，我们无法使用波长更短的光（例如X射线）来进行传统意义上的光学显微观察，因为X射线是电磁波，但需要不同的成像技术。
2. 数值孔径 $ ext{NA} $： 数值孔径越大，分辨率越高。可以通过使用折射率更高的浸液（如油浸、水浸）或设计更大的物镜孔径来提高 $ ext{NA} $。

所以，两千倍的放大倍率并非绝对的数字，而是基于可见光波长和目前高性能物镜数值孔径所能达到的光学分辨率的“有效”放大极限。 超过这个放大倍率，即使图像看起来放大了，但由于分辨率不足，看到的将是模糊一片，无法分辨出更多细节，这被称为“空放大”（Empty Magnification）。

如何“突破”这个限制？

正因为衍射极限是物理规律，我们无法“消除”衍射，但我们可以“绕过”或“规避”它。科学家们为此发展出了多种超分辨率显微镜技术，这些技术巧妙地利用了各种物理和化学原理，巧妙地“骗过”了衍射极限：

1. STED显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，受激饱和发射显微镜）：
原理： STED的核心思想是，在激发目标分子发光的同时，用一个“耗尽光”（depletion beam）围绕激发光斑形成一个环状区域。这个耗尽光会“强制”环状区域内的荧光分子回到基态，停止发光（受激饱和发射）。这样一来，只有处于耗尽光“死角”——耗尽光环中心那个极小的区域内的荧光分子才能发光。通过扫描这个耗尽光环，我们可以逐点地“点亮”和“熄灭”荧光，从而实现比衍射极限更小的成像区域。
效果： 能够达到几十纳米的分辨率。

2. PALM/STORM（Photoactivated Localization Microscopy/Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，光激活定位显微镜/随机光学重建显微镜）：
原理： 这类技术属于“定位显微镜”。它们使用的荧光分子具有一种特殊的性质：可以被激活（发光）一段时间，然后又“暗去”（停止发光），并且可以重新被激活。
步骤：
首先，用非常低的浓度随机激活样本中的一小部分荧光分子，使它们发光。
然后，记录下这些发光分子在相机上的位置（艾里圆的中心），这个定位可以非常精确，远超衍射极限。
接着，让这些发光分子“暗去”，再激活下一批随机选中的荧光分子。
重复这个过程成千上万次，收集所有被定位的分子数据。
最后，将所有定位到的分子“点”汇聚起来，重建出一张超高分辨率的图像。
效果： 理论上可以将分辨率提升到几个纳米。

3. SIM（Simulated Interference Microscopy，结构光照明显微镜）：
原理： SIM并非直接“规避”衍射，而是通过特殊的照明方式来“提取”被衍射限制的高频信息。它使用图案化的光（例如条纹光）来照射样本。当图案化的光与样本的精细结构相互作用时，会产生新的衍射条纹，这些条纹包含了我们平时无法看到的高频信息。通过改变照明图案的角度和相位，并进行复杂的计算，就可以将这些“隐藏”的高频信息恢复出来。
效果： 分辨率通常能提高到衍射极限的一半左右。

4. 其他新兴技术：
MINFLUX（Minimal Photon Flux，最小光子通量）： 结合了STED和PALM/STORM的优点，通过一个追踪的“点”来激活和定位单个荧光分子，实现了前所未有的定位精度。
电子显微镜（Electron Microscopy）： 虽然不属于“光学”显微镜，但电子显微镜（如透射电子显微镜TEM和扫描电子显微镜SEM）通过使用电子束代替光束。电子的德布罗意波长比可见光的光子波长要短得多（尤其是在高加速电压下），因此电子显微镜可以达到远超光学显微镜的分辨率，能够看到原子级别的结构。这从本质上讲，也是利用了更短的“波长”来突破分辨率极限。

总结

所以，您关于光学显微镜放大极限的问题，确实触及了衍射极限这个自然规律。两千倍左右的放大倍率是传统光学显微镜在可见光波长和技术能力下的一个有效极限。

但是，科学的魅力就在于不断探索和创新。通过上述超分辨率显微镜技术，我们已经能够“绕过”衍射极限，将分辨率提升到前所未有的水平，看到过去无法想象的微观世界细节。而电子显微镜更是直接使用了波长更短的粒子，实现了原子级别的观测。

因此，这并非是自然的“不可逾越”，而是需要我们更深入地理解自然规律，并巧妙地利用这些规律来发展新的技术。光学显微镜的发展，正是这样一个不断挑战和突破极限的生动例证。

网友意见

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简而言之，对于用肉眼观测的光学显微镜，大于2000倍就没有必要了。对于使用CCD观察的，就更没有必要了。如何解决在回答的后半部分。

其他的回答把分辨率极限说的很好了。由于可见光波长范围λ的限制（390nm~700nm），即使使用波长最短的紫光，在一般的数值孔径N.A.~1

的约束下，分辨率d很难达到200nm以下。

如何从分辨率过渡到放大倍数呢？最开始的光学显微镜是用肉眼观察的，成像的位置必须让实验猿看的足够清楚。像到肉眼的最佳距离被称为Normal Near point，正确的中文名称叫最近对焦点。在这个距离上的物体能够被大多数人正确对焦。如果像成的再靠近眼睛的话，就会有一些人完全无法对焦了（你能看清自己的眼镜框吗？），即使靠的近，看着大，也是没用的。这里要特别说明一下，中文文献中也把这个概念翻译成“明视距离”，对于大多数人来说，这个距离大约是25cm。

如果光学显微系统的放大倍数是2000倍，对应到200nm的分辨率，这个光学系统的成像能力就相当于呈现0.4mm有限分辨率的像。如果你的眼睛在明视距离25cm无法分辨间距0.4mm的两个物体……那你需要的就不是一个更好的显微镜，而是一副眼镜了。以上论证是为了说明，2000的放大倍数对于人眼已经充分够用，更高的放大倍数不是做不到，只是由于可见光的波长限制了分辨率，放得再大，你在显微镜下看的无非是糊的像，没有意义。鉴于一般光学显微镜的分辨率远不及200nm，更高的放大倍数显然是没必要。

现在很多显微镜都把像成到CCD上面了，原理类似数码相机。很多时候都是直接绕开目镜，直接把物镜的像采集下来。这是为什么呢？光学显微镜的目镜一般都是10x的，这样我们假设物镜的放大倍数是200x，对应的像的解析度是200nm*200=0.04mm。那么CCD的一个像素有多大呢？一般来说，一个像素越大，信号的质量越高。比如单反，尼康D800，像素长度大约为35.9mm/7360~0.005mm,说明CCD的解像能力已经远远超过了200x物镜的成像能力，不用再继续放大了。

下面就是解决方法了，足够写一本书的了。我尽量启发性的给你梳理一下最流行的几种。

从分辨率的定义中我们可以看出，两个独立的点源，被点扩散函数调制，变成了两个糊的圆圈。

来源：

Main Page/BPHS 4090/microscopy I

这里有个非常非常重要的概念：如果画面里只有一个圆圈，那我们能够很准确的定出它的中心和强度。问题在于一个点和它临近的点如果同时发光，在距离比较小的情况下，我们就分不清这是两个小家庭，或者是一个大家庭，这个能分辨的最小距离称为分辨率。

在明确了这个概念之后，就能有对应的解决方案了。

第一，在局部产生信号的同时，不让附近的东西产生信号，直到我们需要探测周围的东西为止。这是大多数超分辨率方法的核心理念。就像上图，如果一个圆圈先出现，另一个暂时不出现，我们就能先定义出一个点的位置，一会儿之后等到第二个圆圈出现，第一个灭掉的时候，再把第二个点的位置确定出来。

1 STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy) 随机光学重建显微术。庄院士和合作者发现了一种能够用光来进行开关的荧光分子团。在强红光照射下，能够把分子团转化为暗态，不产生荧光。在绿光照射下，能把分子团开启，就能产生荧光。具体流程如下：

想得到高分辨率的图像，就要先全部用红光进入暗态，然后用非常弱的绿光打开个别几个分子团，开始一轮成像。然后再全部淬灭，再随机激活几个……如此往复，直到这些分子团被玩儿坏了，永久淬灭了为止。这些每次被点亮的分子团是如此稀疏，使得他们并不互相干扰，每个中心都得以精确的确认，分辨率就上去了。使用这种方式，横向的分辨率能达到20nm，纵向能达到50nm。

来源：

Zhuang lab research

这是STORM（下）和传统成像技术（上）的对比，这个技术2006年刚出来的时候真是把膝盖都跪碎了。有人可能会问这神奇的分子团是啥，其实是花青素类的偶联体，Cy3和Cy5。这才是一花一世界。

2 photo activated localization microscopy (PALM) 光激活定位显微技术。要不说2006是显微技术的奇迹年。这年除了STORM，还有PALM问世。这种技术与STORM大同小异，只是使用了能被405nm光开启，之后才能被488nm激光激发的一种荧光蛋白。与STORM的策略不同的是，在PALM中，首先所有的蛋白都是没有被激活的，然后少量被405nm光开启，受488nm激光照射产生荧光，然后这些被开启的分子就会被大剂量488nm光给漂白，再也亮不起来。然后重新开启405nm光，激活剩下的蛋白，周而复始。如此也能达到不把邻居吵醒的效果。和STORM反复变通的东方智慧相比，PALM是典型的美式简单粗暴哲学。

3 STED （Stimulated emission depletion）受激发射耗尽。不知道题主对激光了解多少，有一个概念叫做受激辐射，大概是说如果电子存在一个比较高的能级上，比较的不稳定；它的下面有很多不同的低能级来接着它，这个电子会朝哪里跃迁呢？如果这时有光子，其能量恰好就是与下面一个能级的能量差，那这个电子就会倾向于发生受激辐射，放出和那个光子能量一样的光子，同时完成跃迁。

这里有两个非常重要的概念：第一，放出的光子能量一样。第二，跃迁会更容易发生，对应的高能级寿命会变短。想象有一个电子被高能量的绿光激发，准备从高能级开始跃迁，发出一个黄的光子。正当它跃跃欲试，准备跳的时候，突然从外面来了个红光，一把就把电子推到了一个比原先的目的地稍高些能量的地方，于是这个电子没能完成当初的计划，只发出来红光。而没被红光推那一下的电子呢，就照常发出黄光。于是思路就有了：用红光包住绿光，形成一个光的夹心冰棍，然后用这个当作光源在样品上面扫。等效的能激发荧光的光源的粗细，就变小了。

来源：

STED microscopy

如上图，左是真实的高斯分布的激发用光，中是耗尽光，把这两束光精确的对在一起就能形成一个尺寸很小的光源。

这种技术的要点在于什么呢？就是如何精确的形成激发光和耗尽光，并且精确的套在一起，并且一起快速的在样品上扫来扫去……这种技术也只能由德国人发明……我们隔壁实验室就有一台，百万美元级。

第二，近场光学。衍射分辨率极限是相对于远场光学而言的。在傅里叶光学中，空间频率高于光源空间频率的空间信息会从表面开始向外按指数衰减，等到了远场就不剩了。所以如果采集的地方足够近，还是能找回一些高频信息的，这样空间分辨率就提高了。

4 Near-field scanning optical microscope (NSOM，近场扫描光学显微镜)近场光存在于据光源一个波长以内的地方。这里的想法是我光源的样子不变，拿一个前段开口的小针贴近样品，这样只有针附近的一点点光才能漏进来，被探测器量化。只要我用这个针把感兴趣的地方扫一遍，就能把近场光采下来了。听起来很美？请参考我之前的回答：

我们通过显微镜看到的原子，是原子的原子核，还是包括电子在内的整个原子？

这种贴近了扫的显微镜都快不了。

5 超材料。这个离实际应用还有一定的距离。话说我曾经想把超材料作为课题，两位大教授我也都申请了，结果都被秒据了……超材料在某些频段上具有反常的物理特性。空间频率高的信号在里面有时不会衰减反而会传播。这里面的物理比较匪夷所思，比如负折射率什么的。把这种材料紧紧贴在样品表面就能把高频信号传出来。

第三，脑洞大开型。这里需要一些傅立叶变换的知识：我想得到一个图像，可以直接在空间上采样，采到的是对应的像素值。或者我可以对空间的傅立叶变换进行采样。得到我感兴趣的图像在傅里叶平面上的值，然后做反傅立叶变换就行了。如何直接得到傅立叶变换的值呢？

6 Structured illumination microscopy (SIM) 结构照明显微术。加州儿女多奇志……UCSF的Mats Gustoffson教授在2000年提出了结构照明概念：虽然我不能将光束无限缩小，但是我可以将空间有规律的进行照明，如果在实空间照明强度的图案是正弦波，那么就相当于做了一次傅立叶变换。另一方面，不同的空间频率可以产生不同的摩尔纹，横向上的空间被拉长转移到纵向上，就能被测量了。

来源：

Ultrafast and Microspectroscopy Laboratories

如上图，不同的结构性光源能够得到不同的摩尔纹，进而解释为空间频率。

只可惜这种方法不能超过普通光学显微镜极限分辨率的两倍。

个人觉得限制分辨率的因素不全是波长。在现在这个科研技术严重过剩的时代，只要有钱，高分辨不是梦想。上面所述的每一种设备都不便宜。相比之下，700人民币就能买个非常不错的2000倍光学显微镜了。实在想要更高分辨率，不还有我们电子显微镜嘛~

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