超高效液相流动相跑干了?
当你的超高效液相色谱（UHPLC）流动相“跑干”时，这是一个非常令人头疼的问题，因为它不仅会导致你的实验中断，还可能对仪器造成损害。理解流动相跑干的原因、后果以及如何预防和应对至关重要。
下面我将尽量详细地讲述这个过程：
什么是UHPLC流动相跑干？
在UHPLC中，流动相是指由溶剂组成的液体，它被高压泵输送到色谱柱，将样品带入色谱柱进行分离。当“流动相跑干”时，意味着为仪器输送流动相的溶剂容器（通常是储液瓶或储液器）中的液体已经完全用完，泵无法继续吸入溶剂来维持系统所需的压力和流速。
流动相跑干通常是如何发生的？
流动相跑干并非单一原因造成，通常是多种因素叠加的结果。以下是一些常见的原因：
1. 溶剂消耗量预估不足：
方法开发/优化阶段： 在方法开发过程中，可能没有充分考虑到溶剂消耗的速度。例如，使用较高的流速、较长的方法运行时间、更复杂的梯度程序（频繁切换溶剂比例）都会显著增加溶剂消耗。
例行运行中的疏忽： 即使是成熟的方法，如果负责操作的分析师没有仔细计算或估算每次运行的溶剂用量，也可能导致溶剂用尽。例如，一次准备了过多的梯度程序，但储液器中的溶剂准备量不足。
批量运行计划不周： 当计划连续运行多个样品时，如果计算每个样品的溶剂消耗量，并将其累加，然后与准备的溶剂总量进行比较，很容易出现问题。
2. 溶剂储备量不充足：
未及时补充： 这是最直接的原因。分析师可能忘记或未能及时检查和补充溶剂储液器。
储液器设计容量限制： 某些仪器的储液器容量可能相对较小，对于长时间运行的分析方法来说，即使定期检查，也可能在不经意间耗尽。
实验室政策或习惯： 有些实验室可能为了避免溶剂浪费或出于其他管理原因，不鼓励一次性配制或准备大量流动相，导致分析师在运行前需要频繁配制，增加了遗漏的风险。
3. 仪器设定错误或异常：
错误设置流速或运行时间： 例如，操作失误导致设置了比预期更高的流速，或者运行时间比实际需要的更长。
仪器故障（较少见，但可能）： 尽管不常见，但如果泵出现意外的流速增加（例如内部泄漏导致补偿性提高输出），也可能加速溶剂消耗。
4. 溶剂管路系统问题：
管路泄漏： 如果溶剂管路、接头或密封件存在泄漏，部分溶剂会在被输送到色谱柱之前就丢失，导致实际到达色谱柱的溶剂少于泵输出的量，间接导致跑干。虽然这通常表现为压力不稳定或低于预期，但长期泄漏累积也会加速储液器的消耗。
管路堵塞（反向效应）： 尽管堵塞通常会导致压力升高，但在某些极端的堵塞情况下，如果泵尝试通过提高压力来克服堵塞，并且管路内存在未被完全清除的空气，可能会吸入更多空气，然后泵试图通过提高压力将空气排出，从而加快溶剂消耗（但这种情况非常罕见，通常会直接表现为压力下降或波动）。
5. 分析方法本身的特点：
高流速： UHPLC通常使用比HPLC更高的流速（如0.52.0 mL/min，甚至更高）。
长时间运行： 一些复杂的分离需要数十分钟甚至数小时。
多通道溶剂系统： 如果你的仪器有多个泵头，同时使用多个溶剂通道（例如，A、B、C、D溶剂），那么所有这些溶剂的消耗速度都需要被考虑。
自动进样器循环次数： 自动进样器连续运行大量的样品，其累积的溶剂消耗量会非常可观。
流动相跑干的直接后果（为什么如此糟糕）：
流动相跑干对UHPLC而言是灾难性的，其后果主要体现在以下几个方面：
1. 对色谱柱的严重损害：
柱填料干燥/损坏： 色谱柱内的固定相（填料）必须始终被流动相润湿。当流动相跑干时，泵停止输液，但由于惯性或仪器设计，管路内的压力可能会瞬间下降，此时柱前和柱内的溶剂会迅速蒸发或被吸入到更干燥的管路中。
填料收缩或碎裂： 特别是对于粒径非常小的UHPLC色谱柱，填料在干燥后容易收缩，破坏其结构和均匀性。一旦填料结构被破坏，柱效将大幅下降，甚至完全失效，无法再用于分离。
不可逆吸附： 如果样品组分或流动相中的杂质在填料干燥时与填料发生不可逆的吸附，也会永久性地影响柱子的分离性能。
2. 对仪器其他部件的潜在损害：
泵：
吸入空气： 当溶剂耗尽时，泵会吸入空气，导致泵头失压。如果仪器没有及时检测到并停止运行，长时间吸入空气可能会导致泵密封件过早磨损、损坏，甚至影响其精密部件。
干磨： 在某些情况下，泵头可能在没有润滑（溶剂）的情况下运转，导致部件之间的干磨，加速磨损。
检测器：
光学部件污染： 如果检测器是紫外可见（UVVis）检测器，在流动相跑干后，可能未被充分冲洗的样品或流动相杂质会在流通池内干燥、结晶，污染流通池，影响其光学性能，甚至需要专业的清洗才能恢复。
质谱（MS）接口： 如果是液质联用，泵的异常会立即影响MS的进样，可能导致离子源的污染或干燥。
自动进样器： 尽管自动进样器本身可能不会直接损坏，但它会继续执行其程序，例如清洗溶剂（如果程序中包含），但由于主流动相缺失，整个系统无法正常工作，导致后续操作的混乱和数据的丢失。
3. 数据丢失和实验中断：
无有效数据： 当流动相跑干时，系统压力会急剧下降，色谱峰会变形、消失，或者根本无法产生任何有意义的分离信息。所有正在运行或即将运行的样品数据都将无效。
实验周期浪费： 整个运行周期（包括样品准备、仪器设置、运行时间等）将付之东流，需要重新开始。
错过重要时间点： 在某些研究中，可能需要连续监测某个过程，流动相跑干会导致重要的监测数据丢失。
如何预防流动相跑干？
预防是关键！以下是一些有效的预防措施：
1. 仔细计算流动相消耗量：
明确总运行时间： 了解每次运行的总时间，包括准备时间、样品分析时间、平衡时间等。
了解方法流速： 记录方法中设置的流速（例如，0.5 mL/min）。
计算单个样品所需溶剂总量： 单个样品消耗溶剂量 ≈ 流速 × 运行时间。例如，0.5 mL/min × 60 min = 30 mL。
考虑梯度程序： 如果是梯度洗脱，需要计算在不同梯度组成的阶段，总的溶剂消耗量。或者，更简单地，记录总的运行时间即可。
考虑系统体积： UHPLC的系统体积相对较小，但仍需将管路体积、自动进样器环体积、进样器阀体积以及色谱柱体积考虑在内。然而，最简单的计算方法是根据“流速 x 总运行时间”来估算。
批量运行计算： 如果要运行N个样品，总消耗量 ≈ (单个样品消耗溶剂量 + 每次进样前的平衡时间消耗溶剂量) × N。留有足够的余量非常重要。
2. 充足的溶剂储备：
提前准备： 确保在开始运行前，所有使用的流动相储液器（包括溶剂A、B、C、D等，以及清洗溶剂、平衡溶剂）都已加满，并且留有至少1.52倍的预估消耗量作为安全余量。
使用大容量储液器： 如果条件允许，考虑使用更大容量的储液器，尤其是在进行长时间或大量样品运行时。
定期检查与补充： 在运行期间，定期检查储液器液位，特别是长周期运行或通宵运行时。
3. 优化方法：
降低不必要的流速： 如果分离度允许，尝试降低流速以减少溶剂消耗。
缩短不必要的运行时间： 检查方法是否包含不必要的平衡时间或收集时间。
优化梯度： 某些情况下，优化梯度可以减少总运行时间，从而降低溶剂消耗。
4. 使用仪器功能：
低液位警报/自动停机： 许多UHPLC系统都具备“溶剂低液位检测”功能。确保此功能已启用，并且设置的报警阈值是恰当的（例如，在溶剂低于某个百分比时发出警报或自动停止系统）。了解并正确设置这些功能是至关重要的。
运行监控： 在运行过程中，密切关注仪器软件中的流速、压力以及溶剂液位显示。一旦发现异常（如压力下降、溶剂液位快速下降），立即采取措施。
5. 规范操作：
建立标准操作程序（SOP）： 为流动相的准备、注入和仪器运行建立明确的SOP，并对所有操作人员进行培训。
交接班制度： 在实验室进行人员交接班时，必须明确告知流动相的准备情况、储液器液位以及正在进行的实验状态。
6. 定期维护：
检查管路密封性： 定期检查所有管路连接是否紧密，有无渗漏。
校准流速和压力传感器： 确保仪器的流速和压力传感器工作正常，以提供准确的读数。
当流动相跑干已经发生，该怎么办？
不幸的是，如果流动相真的跑干了，并且仪器还在运行，已经造成了损害。此时应该：
1. 立即停止仪器运行： 这是首要步骤，以防止进一步的损害。
2. 评估损害程度：
检查色谱柱： 这是最关键的一步。如果可能，不要立即使用该色谱柱进行分析。如果怀疑柱子已损坏，可以尝试使用推荐的溶剂重新浸润柱子，然后测试其性能（例如，使用标准样品进行分析）。但通常情况下，柱子很可能已经损坏。
检查仪器： 观察泵头是否有异常声音，检查流通池是否有沉积物。
3. 恢复系统：
重新填充流动相： 将新的流动相充满储液器。
排气： 彻底排空整个管路系统，确保没有空气进入泵或管路。从储液器开始，一直到检测器末端，都要确保没有空气残留。对于泵头，可能需要按照仪器手册的指示进行特殊的排气操作。
平衡系统： 以较低的流速运行系统一段时间，确保所有部件都重新被流动相润湿，并且压力和流速稳定。
4. 测试仪器和色谱柱：
测试空载： 不进样，在相同的条件下运行一段时间，观察压力是否稳定，基线是否平滑。
测试标准品： 使用已知性能的混合标准品进行分析，评估分离度、峰形和重现性。
总结
UHPLC流动相跑干是一个严峻的问题，通常是由于对溶剂消耗量估计不足或储备不足所致。它可能导致昂贵的UHPLC色谱柱永久性损坏以及仪器其他部件的损伤，并造成大量宝贵的时间和数据丢失。因此，严格的计划、细致的计算、充足的储备和对仪器功能的充分利用是避免这一问题的关键。
如果一旦发生，立即停止是止损的关键，但随之而来的修复和评估工作往往是耗时且昂贵的。吸取教训，改进操作流程，才能更好地保障实验的顺利进行。
下面我将尽量详细地讲述这个过程：
什么是UHPLC流动相跑干？
在UHPLC中，流动相是指由溶剂组成的液体，它被高压泵输送到色谱柱，将样品带入色谱柱进行分离。当“流动相跑干”时，意味着为仪器输送流动相的溶剂容器（通常是储液瓶或储液器）中的液体已经完全用完，泵无法继续吸入溶剂来维持系统所需的压力和流速。
流动相跑干通常是如何发生的？
流动相跑干并非单一原因造成，通常是多种因素叠加的结果。以下是一些常见的原因：
1. 溶剂消耗量预估不足：
方法开发/优化阶段： 在方法开发过程中，可能没有充分考虑到溶剂消耗的速度。例如，使用较高的流速、较长的方法运行时间、更复杂的梯度程序（频繁切换溶剂比例）都会显著增加溶剂消耗。
例行运行中的疏忽： 即使是成熟的方法，如果负责操作的分析师没有仔细计算或估算每次运行的溶剂用量，也可能导致溶剂用尽。例如，一次准备了过多的梯度程序，但储液器中的溶剂准备量不足。
批量运行计划不周： 当计划连续运行多个样品时，如果计算每个样品的溶剂消耗量，并将其累加，然后与准备的溶剂总量进行比较，很容易出现问题。
2. 溶剂储备量不充足：
未及时补充： 这是最直接的原因。分析师可能忘记或未能及时检查和补充溶剂储液器。
储液器设计容量限制： 某些仪器的储液器容量可能相对较小，对于长时间运行的分析方法来说，即使定期检查，也可能在不经意间耗尽。
实验室政策或习惯： 有些实验室可能为了避免溶剂浪费或出于其他管理原因，不鼓励一次性配制或准备大量流动相，导致分析师在运行前需要频繁配制，增加了遗漏的风险。
3. 仪器设定错误或异常：
错误设置流速或运行时间： 例如，操作失误导致设置了比预期更高的流速，或者运行时间比实际需要的更长。
仪器故障（较少见，但可能）： 尽管不常见，但如果泵出现意外的流速增加（例如内部泄漏导致补偿性提高输出），也可能加速溶剂消耗。
4. 溶剂管路系统问题：
管路泄漏： 如果溶剂管路、接头或密封件存在泄漏，部分溶剂会在被输送到色谱柱之前就丢失，导致实际到达色谱柱的溶剂少于泵输出的量，间接导致跑干。虽然这通常表现为压力不稳定或低于预期，但长期泄漏累积也会加速储液器的消耗。
管路堵塞（反向效应）： 尽管堵塞通常会导致压力升高，但在某些极端的堵塞情况下，如果泵尝试通过提高压力来克服堵塞，并且管路内存在未被完全清除的空气，可能会吸入更多空气，然后泵试图通过提高压力将空气排出，从而加快溶剂消耗（但这种情况非常罕见，通常会直接表现为压力下降或波动）。
5. 分析方法本身的特点：
高流速： UHPLC通常使用比HPLC更高的流速（如0.52.0 mL/min，甚至更高）。
长时间运行： 一些复杂的分离需要数十分钟甚至数小时。
多通道溶剂系统： 如果你的仪器有多个泵头，同时使用多个溶剂通道（例如，A、B、C、D溶剂），那么所有这些溶剂的消耗速度都需要被考虑。
自动进样器循环次数： 自动进样器连续运行大量的样品，其累积的溶剂消耗量会非常可观。
流动相跑干的直接后果（为什么如此糟糕）：
流动相跑干对UHPLC而言是灾难性的，其后果主要体现在以下几个方面：
1. 对色谱柱的严重损害：
柱填料干燥/损坏： 色谱柱内的固定相（填料）必须始终被流动相润湿。当流动相跑干时，泵停止输液，但由于惯性或仪器设计，管路内的压力可能会瞬间下降，此时柱前和柱内的溶剂会迅速蒸发或被吸入到更干燥的管路中。
填料收缩或碎裂： 特别是对于粒径非常小的UHPLC色谱柱，填料在干燥后容易收缩，破坏其结构和均匀性。一旦填料结构被破坏，柱效将大幅下降，甚至完全失效，无法再用于分离。
不可逆吸附： 如果样品组分或流动相中的杂质在填料干燥时与填料发生不可逆的吸附，也会永久性地影响柱子的分离性能。
2. 对仪器其他部件的潜在损害：
泵：
吸入空气： 当溶剂耗尽时，泵会吸入空气，导致泵头失压。如果仪器没有及时检测到并停止运行，长时间吸入空气可能会导致泵密封件过早磨损、损坏，甚至影响其精密部件。
干磨： 在某些情况下，泵头可能在没有润滑（溶剂）的情况下运转，导致部件之间的干磨，加速磨损。
检测器：
光学部件污染： 如果检测器是紫外可见（UVVis）检测器，在流动相跑干后，可能未被充分冲洗的样品或流动相杂质会在流通池内干燥、结晶，污染流通池，影响其光学性能，甚至需要专业的清洗才能恢复。
质谱（MS）接口： 如果是液质联用，泵的异常会立即影响MS的进样，可能导致离子源的污染或干燥。
自动进样器： 尽管自动进样器本身可能不会直接损坏，但它会继续执行其程序，例如清洗溶剂（如果程序中包含），但由于主流动相缺失，整个系统无法正常工作，导致后续操作的混乱和数据的丢失。
3. 数据丢失和实验中断：
无有效数据： 当流动相跑干时，系统压力会急剧下降，色谱峰会变形、消失，或者根本无法产生任何有意义的分离信息。所有正在运行或即将运行的样品数据都将无效。
实验周期浪费： 整个运行周期（包括样品准备、仪器设置、运行时间等）将付之东流，需要重新开始。
错过重要时间点： 在某些研究中，可能需要连续监测某个过程，流动相跑干会导致重要的监测数据丢失。
如何预防流动相跑干？
预防是关键！以下是一些有效的预防措施：
1. 仔细计算流动相消耗量：
明确总运行时间： 了解每次运行的总时间，包括准备时间、样品分析时间、平衡时间等。
了解方法流速： 记录方法中设置的流速（例如，0.5 mL/min）。
计算单个样品所需溶剂总量： 单个样品消耗溶剂量 ≈ 流速 × 运行时间。例如，0.5 mL/min × 60 min = 30 mL。
考虑梯度程序： 如果是梯度洗脱，需要计算在不同梯度组成的阶段，总的溶剂消耗量。或者，更简单地，记录总的运行时间即可。
考虑系统体积： UHPLC的系统体积相对较小，但仍需将管路体积、自动进样器环体积、进样器阀体积以及色谱柱体积考虑在内。然而，最简单的计算方法是根据“流速 x 总运行时间”来估算。
批量运行计算： 如果要运行N个样品，总消耗量 ≈ (单个样品消耗溶剂量 + 每次进样前的平衡时间消耗溶剂量) × N。留有足够的余量非常重要。
2. 充足的溶剂储备：
提前准备： 确保在开始运行前，所有使用的流动相储液器（包括溶剂A、B、C、D等，以及清洗溶剂、平衡溶剂）都已加满，并且留有至少1.52倍的预估消耗量作为安全余量。
使用大容量储液器： 如果条件允许，考虑使用更大容量的储液器，尤其是在进行长时间或大量样品运行时。
定期检查与补充： 在运行期间，定期检查储液器液位，特别是长周期运行或通宵运行时。
3. 优化方法：
降低不必要的流速： 如果分离度允许，尝试降低流速以减少溶剂消耗。
缩短不必要的运行时间： 检查方法是否包含不必要的平衡时间或收集时间。
优化梯度： 某些情况下，优化梯度可以减少总运行时间，从而降低溶剂消耗。
4. 使用仪器功能：
低液位警报/自动停机： 许多UHPLC系统都具备“溶剂低液位检测”功能。确保此功能已启用，并且设置的报警阈值是恰当的（例如，在溶剂低于某个百分比时发出警报或自动停止系统）。了解并正确设置这些功能是至关重要的。
运行监控： 在运行过程中，密切关注仪器软件中的流速、压力以及溶剂液位显示。一旦发现异常（如压力下降、溶剂液位快速下降），立即采取措施。
5. 规范操作：
建立标准操作程序（SOP）： 为流动相的准备、注入和仪器运行建立明确的SOP，并对所有操作人员进行培训。
交接班制度： 在实验室进行人员交接班时，必须明确告知流动相的准备情况、储液器液位以及正在进行的实验状态。
6. 定期维护：
检查管路密封性： 定期检查所有管路连接是否紧密，有无渗漏。
校准流速和压力传感器： 确保仪器的流速和压力传感器工作正常，以提供准确的读数。
当流动相跑干已经发生，该怎么办？
不幸的是，如果流动相真的跑干了，并且仪器还在运行，已经造成了损害。此时应该：
1. 立即停止仪器运行： 这是首要步骤，以防止进一步的损害。
2. 评估损害程度：
检查色谱柱： 这是最关键的一步。如果可能，不要立即使用该色谱柱进行分析。如果怀疑柱子已损坏，可以尝试使用推荐的溶剂重新浸润柱子，然后测试其性能（例如，使用标准样品进行分析）。但通常情况下，柱子很可能已经损坏。
检查仪器： 观察泵头是否有异常声音，检查流通池是否有沉积物。
3. 恢复系统：
重新填充流动相： 将新的流动相充满储液器。
排气： 彻底排空整个管路系统，确保没有空气进入泵或管路。从储液器开始，一直到检测器末端，都要确保没有空气残留。对于泵头，可能需要按照仪器手册的指示进行特殊的排气操作。
平衡系统： 以较低的流速运行系统一段时间，确保所有部件都重新被流动相润湿，并且压力和流速稳定。
4. 测试仪器和色谱柱：
测试空载： 不进样，在相同的条件下运行一段时间，观察压力是否稳定，基线是否平滑。
测试标准品： 使用已知性能的混合标准品进行分析，评估分离度、峰形和重现性。
总结
UHPLC流动相跑干是一个严峻的问题，通常是由于对溶剂消耗量估计不足或储备不足所致。它可能导致昂贵的UHPLC色谱柱永久性损坏以及仪器其他部件的损伤，并造成大量宝贵的时间和数据丢失。因此，严格的计划、细致的计算、充足的储备和对仪器功能的充分利用是避免这一问题的关键。
如果一旦发生，立即停止是止损的关键，但随之而来的修复和评估工作往往是耗时且昂贵的。吸取教训，改进操作流程，才能更好地保障实验的顺利进行。
网友意见
泵做好purge了吗？流速恢复之后，把色谱柱冲洗时间长一些，使色谱柱中的填料恢复浸润。你看一下Waters的一些资料就了解了，流动相干了以后发生了De-wetting。
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