《自然》重磅发现癌基因存在于环形染色体外脱氧核糖核酸（ecDNA）能否带来癌症治疗领域的第四次革命？

首先恭喜 @吴思涵 发表Nature正刊文章！这篇文章的重点在摘要里讲得非常清楚。关于ecDNA，这东西其实对于做FISH成像的人而言是比较烦人的，因为如果遇到ecDNA比较多的细胞系或者组织，这玩意就在细胞核边上，让人比较难判断到底是FISH的杂信号还是真实的FISH信号点。具体有多烦人，可以看这个图：

图片来自2018年的Nat Genetic：https://www.nature.com/articles/s41588-018-0105-0

看了一些回答发现有些人刚开始有先入为主的观点。ecDNA首次发现在文章中说的很清楚，包括癌基因在ecDNA上的拷贝数激增，这个在之前都有文献报道。比如HL60细胞系，癌基因在ecDNA上的拷贝数有的细胞能到200多个。这些ecDNA上的癌基因理论上可以更快的积累mutation (https://www.nature.com/articles/ncomms6690),但是ecDNA也很容易失去. ecDNA对于癌细胞而言有点锦上添花的意思, 让癌细胞能更灵活的应对肿瘤环境的变化从而获得优势, 但是丢失了也不影响癌症的发展 (有没有让你想起质粒?). 这一特点会让针对ecDNA开发的癌症治疗方案变得异常困难.

补充一点，ecDNA不仅仅在癌细胞里面有，在正常组织里面也有, 比如2018年这篇Nat Comm：https://www.nature.com/articles/s41467-018-03369-8 按照这篇文章的说法, 他们发现的大部分ecDNA小于25Kb。

补充二点, 除了lagging chromosome导致的DSB产生ecDNA之外, Oxidative Stress, Senescence也会造成染色体, 尤其是端粒附近的染色体断裂或者碎片化, 也就是T-circles DNA. 关于ecDNA, 有篇综述可以参考: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168952517302305

根据吴思涵的文章, 可能今后在处理Hi-C数据的时候,对于ecDNA 贡献的那些Contacts,要小心一些.尤其对于做基于Hi-C数据来预测chromatin interaction的人而言, 需要根据情况筛出哪些来自于ecDNA,哪些来自于chromosome.

有意思的是最近有人在猜想环状ＤＮＡ跟环状ＲＮＡ的关系: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00940/full

Anyway, 如果能在活细胞内track环状DNA形成到转录出chimeric RNA或者circRNA的过程, 将会非常有意思. 两年前遇见Anindya Dutta的时候, 他就想做这个工作了, 问我感不感兴趣一起合作, 毕竟我主要做成像技术和标记方法. 不过当时我在找工作, 就十动然拒了, 不知道他现在做出来没有. (手动笑哭)

最后, ecDNA能否为癌症治疗带来新的靶点?这个有可能. 直接的影响应该在肿瘤检测与诊断上, 毕竟可以针对ecDNA开发临床检测试剂盒以及相关仪器. 癌症的治疗手段, 从手术,放射,到化疗,以及最近的免疫疗法(抗体, 疫苗以及细胞疗法),确实治疗手段越来越多, 但是基础研究的发现和进步translate到临床, 技术进步往往比biology更容易带来新的治疗手段. 不过, 如果针对ecDNA, 目前来看, 确实可以期待genome editing工具开发而来的治疗手段, 但是会非常困难. 具体原因我已经在回答中加粗显示了.

比起Target Specific ecDNAs, 对于开发癌症治疗手段更有意义的是研究肿瘤细胞如何调控ecDNA, 以及ecDNA如何调控影响肿瘤细胞的生长, 从而更好的理解ecDNA的肿瘤生物学意义, 并且根据这些理解设计的肿瘤治疗方案被验证确实能让特定肿瘤类型的患者获益, 那么这种新的疗法自然也就离临床不远了.

大佬 @李雷 和 @吴思涵 都讲了这个发现，我从一个前肺癌医生的角度讲一讲我觉得可能的应用。

①目前已知的人染色体外环状DNA

人的体内除了本次吴大佬他们团队发现的原癌基因脱落形成的染色体外环状DNA，目前存在的染色体外环状DNA包括：存在于细胞器内的线粒体DNA、叶绿体DNA、 和动基体等，以及非细胞器eceDNAs[包括附加体、双微体(DMs)、小多分散环状DNA(spcDNAs)、miDNAs]。

这些环状DNA具有明显的异质性，也就是各种特点都不一样，包括大小和结构，大的甚至可以直接通过光镜看见。

但是很多都和癌症有一定关联，比如附加体可以扩展癌基因和耐药基因影响癌症的发展和化疗，双微体扩展癌基因和耐药基因使得癌症有了更强的侵袭能力和对化疗的耐受能力。

而这些环状染色体在细胞死亡之后是会释放到血液循环中的，因此可以通过液体活检等方式检测到。

②肿瘤的监测和诊断

吴大佬的采访中提到这类环状DNA非常的稳定，不易被降解[1]，因此如果在液体活检中检测这类环状DNA是可以提供癌症的超早期诊断的，而且这个环状DNA是可以对治疗起反应的，因此还可以作为癌症患者的治疗后评价指标。

但是目前来说，健康组织当中也大量存在着这种环状DNA[2]，我们应用之前，还需要解决其来源的鉴别。

②与治疗相关的反应

目前已有一些研究在做关于环状DNA与治疗相关的反应，比如哈尔滨医科大学的研究者发现使用抗癌药吉西他滨(gemcitabine)可以有效消除双微体，同时减缓癌细胞的生长、繁殖[3]。

③本身作为一个靶点用于治疗

不同的染色体外环状DNA有着不同的形成机制，但是目前并不太清楚具体的形成机制，只知道是染色体从DNA序列上脱落环化而成，那么是什么维持了它们的稳定性？如果找到这一点，是不是可以从源头上打击肿瘤？

第二点由于这些基因具有极强的自主复制能力，那我们是不是可以抑制其复制能力，而影响肿瘤的发生、发展？

[1]https://mp.weixin.qq.com/s/NWSkUbHyHg_xDddLTppRQw

[2]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29540679

[3]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23991020/

恭喜 @吴思涵 大佬，真的是革命性的研究！

已经有 @李雷 还有吴大佬自己的解读了，我就不班门弄斧了。不过看完文章以后还是觉得有很多东西可以做的。

1. ecDNA的形成机制和形成原因是否有统一和清晰的机制？它们的转录，复制是否也是和chromatin上一样共用一套机制？毕竟环和线性DNA还是不同的。
2. 不同癌症中的ecDNA是否为普遍现象？当然根据吴大佬他们组的paper认为是普遍现象，但还是需要有人干脏活累活，在不同的细胞系，组织及动物模型中进一步验证。
3. 在NO.2 的基础上，ecDNA是否具有癌症种类的特异性？
4. ecDNA是否会在细胞之间进行传递？是否会有类似微生物传递质粒的性质？传递过ecDNA的细胞能否变为癌细胞？
5. 在NO.4的基础上，如果在癌细胞中干掉其重要的ecDNA，能否将癌细胞一定程度的回归正常？
6. 怎么干掉ecDNA？用CRISPR-Cas9系统？

其中，第5点最为重要，如果能够通过干掉ecDNA使癌细胞回归正常细胞，那么就会打开治疗癌症新世界的大门。

此外，特别佩服这种原创性的研究，这种研究才真的是开创一个新领域，能过为众多研究人员打开一个新领域的大门；而不是某些人，靠堆人力物力搞军备竞赛，在有限的领域、有限问题里互相抢饭碗。

最后，再次恭喜吴大佬，也预祝大佬能顺利找到position ！

看了一下Paul Mischel他们组14年的Science^[1]和17年的Nature^[2]，算不上评价，给 @李雷 的回答进一步解释一点，因为不是做肿瘤的，还请多指正 @吴思涵 。

这篇文章^[3]的重点根本不是发现癌基因存在在环形的ecDNA，也不是所谓的“重新发现”双微体（double minutes），用这两个质疑的是不是只看了什么公众号文章没读文献（这文章标题里那么大一个accessible chromatin）……不过这题目问的也是，怎么突然就革命了……

Approximately 30% of the ecDNA were paired double minutes (Source Data of Fig. 2). [2]

Mischel教授在17年的Nature中用大量的测序数据指出ecDNA可在约1/3的人类癌症中找到（还建立了研究方法和包），但极少在正常细胞中出现（这是那篇Nature的观点，不同的意见可参考评论区置顶的 @张旭 发的文献），并且确认了癌基因其实常常是在这些ecDNA上进行大量的扩增，认为这些ecDNA为肿瘤异质性的发展相较染色体DNA更为重要。

而这篇文献主要的贡献有：

1. 原先的文献集中于测序数据，这篇文章直接观察了环状的ecDNA，且用Correlative light and electron microscopy等表征手段给出了环状ecDNA是环状的直接证据。

2. 通过全基因组测序和RNA测序的数据结合SNP，他们可以确认转录出来的RNA到底是来自于ecDNA还是在染色体上的原始loci。其结果显示这些癌基因转录主要来源于ecDNA而不是原先的loci，不仅如此其转录水平还往往很高，这说明这些ecDNA的表达对于癌细胞的生存以及肿瘤的进展有很重要的作用。

3. 【重点】使用ChIP-seq来免疫沉淀并测序与H3K4me1和H3K27ac等组蛋白修饰结合的DNA序列（以及免疫染色+FISH），他们发现这些ecDNA与代表基因活跃转录的组蛋白修饰常常出现，而H3K9me3和H3K27me3等抑制性的组蛋白修饰则较少（这部分以前确实有类似报道^[4]）。在此基础上，使用Chang组发展的ATAC-seq（利用Tn5往基因组的“开”区域插片段），以及MNase-seq技术，可以进一步检测出这些基因的开/闭状态（或者说accessibility，抱歉我真不知道中文怎么说了），结果表明这些ecDNA往往相较于染色体DNA而言更“开放”，进一步说明了ecDNA为何会大量转录。

4. 又一个技术proximity ligation-assisted ChIP–seq（吐个槽这是Hi-C+ChIP-seq吗？），利用测序方法研究染色体的3D结构但只看感兴趣的ChIP富集的那部分，这个远端的作用再一次证明了ecDNA的环状特征。以及ecDNA不仅有组蛋白还有topologically associating domains（TAD）……emmmmmmmmmmmm……这跟想象中的质粒越差越远了……相对于没有ecDNA的U87细胞系，其超过1000 kb处的作用证明ecDNA有超长距离的染色体相互作用。

对于基础科学研究，说这篇文章可以带来非常直接的价值或者革命目前看来还是有些言过其实，但ecDNA确实可能成为癌症治疗的一个新的靶点。

几个月前，Nature上发表了一篇早期癌症转移相关的文章^[5]，研究者使癌细胞表达一种穿膜荧光蛋白，该蛋白可被周围的细胞摄取，从而可以利用FACS技术将这些靠近早期癌症转移位点的正常细胞从组织里分离出来进行研究。他们发现早期癌症转移的癌细胞会通过某些方式将周围的细胞获得一些类似干细胞的性质。至于这种转化是怎样发生的又跟ecDNA有没有关系……此处可以考虑写本子了。

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早上师兄说有篇新的关于ecDNA的Nature做的非常不错，还跟我们隔壁楼的大牛Howard Chang有合作，今天讲组会没看SNS什么的等到下午的时候发现满票圈已经都是这篇了：Nature重大发现：癌基因竟不在染色体上？第一作者吴思涵亲身解读！

等一下……这一作不是吴老师 @吴思涵 么?

刷了下群聊（要素发觉）

很惭愧，就做了一点微小的工作

参考

1. ^ Nathanson, D. A., Gini, B., Mottahedeh, J., Visnyei, K., Koga, T., Gomez, G., ... & Paucar, A. (2014). Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science, 343(6166), 72-76.
2. ^ Turner, K. M., Deshpande, V., Beyter, D., Koga, T., Rusert, J., Lee, C., ... & Kornblum, H. I. (2017). Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature, 543(7643), 122.
3. ^ https://www.nature.com/articles/s41586-019-1763-5#Sec6
4. ^ Mitsuda, S. H., & Shimizu, N. (2016). Epigenetic repeat-induced gene silencing in the chromosomal and extrachromosomal contexts in human cells. PloS one, 11(8), e0161288.
5. ^ Ombrato, L., Nolan, E., Kurelac, I., Mavousian, A., Bridgeman, V. L., Heinze, I., ... & Weston, A. (2019). Metastatic-niche labelling reveals parenchymal cells with stem features. Nature, 572(7771), 603-608.

谢谢 @KellyWeaver 邀请。

首先膜拜大佬 @吴思涵 ，感谢大佬的优质工作为我们的报道提供最真实最前沿的素材。

以下为BioArt今日对该工作的部分解读。

导读：

结构决定功能。DNA不仅以碱基序列储存遗传信息，还可以通过改变高级结构，来指导遗传信息的选择性表达。人类的基因组DNA，通过与蛋白质相结合，进而折叠、压缩，形成高级结构，并最终形成23对染色体。这样的高级结构，对细胞执行正常的生理功能而言，是至关重要的。然而，在肿瘤中，这样的高级结构会出现异常，导致基因异常表达——这其中就包括了原癌基因。通过全基因组测序技术，我们已经大量解析了原癌基因的序列异常，包括扩增、碱基突变、转位等。但是，我们不禁要问一个问题：原癌基因到底存在于什么位置？

教科书告诉我们，基因存在于染色体上。但是，假如我们通过测序，发现有100个拷贝的原癌基因在某个染色体区域中扩增，我们是否能说，这100个拷贝的原癌基因，就都位于那条染色体的那个位置上呢？

实际上，在2017年的Nature杂志上，来自美国加州大学圣迭戈分校的Paul Mischel教授团队便指出，肿瘤中大量扩增的原癌基因，其实是以染色体外DNA（extrachromosomal DNA，简称ecDNA）的形式存在的【1】。不过，ecDNA的结构是什么，它具有什么功能，一直缺乏直接的证据。

2019年11月21日，Paul Mischel教授团队再一次在Nature杂志上发表了长文文章Circular ecDNA promotes accessible chromatin andhigh oncogene expression，首次解析了ecDNA的结构与功能。

该研究主要有以下4个突破性成果：

1） ecDNA是环状的；

解析ecDNA的结果，是阐明ecDNA功能的第一步。研究团队首先结合二代全基因组测序和光学匹配（optical mapping），从序列的角度发现，扩增出来的ecDNA形成了环状结构。团队进一步使用影像学的方法，包括扫描电镜、透射电镜、3D结构照明显微镜等方法，获得了环状DNA的清晰图片证据，最终证实了肿瘤中的ecDNA确实是环状的。

2） ecDNA大量表达癌基因

通过RNA-seq技术并结合SNP分析，研究团队发现，肿瘤中的环状ecDNA也能指导基因的转录。由于ecDNA的拷贝数往往较高（甚至比扩增于染色体的拷贝数更高），且携带癌基因，因此在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于ecDNA的。通常，这些高拷贝的ecDNA，能使得癌基因的转录丰度，上升至整个转录组的前1%。

3） ecDNA的染色质是高度开放的

拷贝数是决定基因表达量的重要因素，但不是唯一因素。DNA的表观遗传修饰以及三维结构，能够决定基因是否表达。研究团队使用了ChIP-seq和免疫荧光技术，证实了ecDNA同样具有染色质结构，由核小体单元构成。同时，ecDNA上含有增强子与启动子的组蛋白修饰（H3K4me1/3，H3K27ac），但却缺乏抑制性组蛋白修饰，如H3K9me3与H3K27me3。通过ATAC-seq，MNase-seq，以及ATAC-see，研究团队进一步发现，ecDNA的染色质是高度开放的，进一步解释了为何ecDNA上的癌基因能够大量表达。

4） ecDNA的环状结构介导超远距离相互作用

染色质的三维结构，允许DNA元件之间发生相互作用。比如染色质成环，介导了增强子与启动子之间的相互作用，从而推动基因的表达。这种相互作用频率，会随着空间距离的增大而减小。研究团队使用染色质构象捕获及测序技术，PLAC-seq（或者叫Hi-ChIP，一种信息简并的Hi-C技术）和4C-seq，以及CTCF与SMC3的ChIP-seq，证实了ecDNA染色质也能形成三维结构，并且存在拓扑相关结构域。同时，由于ecDNA形成了环状结构，远处的DNA元件，就被带到了近处，从而实现了超远距离的相互作用。而这种超远距离的相互作用，还可能形成了新的基因调控回路。

ecDNA环状图谱，将全基因组测序，RNA-seq和ATAC-seq数据整合为一的数据可视化方式。

最后，作者指出，环状的ecDNA在肿瘤中普遍存在，同时由于缺乏着丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传。这样的特性，使得ecDNA是驱动肿瘤异质性的重要机制，这将对肿瘤的治疗带来极大的挑战。

据悉，文章的第一作者是来自中国的吴思涵博士。吴博士2014年于中山大学中山医学院取得博士学位后，加入美国加州大学圣迭戈分校Paul Mischel教授团队，从事肿瘤遗传学于代谢研究。

原文链接：

参考文献

1. Extrachromosomal oncogene amplification drivestumour evolution and genetic heterogeneity.Nature,volume 543, pages122–125(2017)