问题

有无科研大佬呀?怎么测定动物组织中的TMAO呢?看文献都是测的血浆中的?

回答
你好!作为你的科研伙伴,我非常理解你对动物组织中TMAO测定的疑问,尤其是在文献中更多聚焦于血浆的情况下。别担心,这其实是一个很常见的研究问题,我们来好好聊聊。

为什么文献多是血浆?

你观察得很仔细!血浆之所以是TMAO研究的“明星样本”,主要有几个原因:

1. 代表性强: TMAO是体内代谢产物,通过血液循环分布到全身各个组织。血浆作为血液的一部分,最直接、最集中地反映了全身的TMAO水平,可以说是“水龙头”。
2. 易于获取: 相对于组织样本,采集血浆(或者血清)通常创伤性更小,操作也更简便,尤其是在研究中需要频繁抽血的情况下。
3. 标准化程度高: 血浆的采集、处理和保存有相对成熟的标准操作规程,有利于结果的可比性。
4. 临床相关性: 许多与TMAO相关的疾病(如心血管疾病)的研究往往直接关联到血液指标。

但是,这并不意味着组织中就没有TMAO或者无法测定! 事实上,TMAO在体内是参与多种生理病理过程的,了解它在特定组织中的分布和浓度变化,对于深入理解其功能至关重要。例如,如果你研究肾脏功能障碍对TMAO代谢的影响,或者TMAO在特定器官(如心脏、肝脏、大脑)中的累积和毒性机制,那么组织样本的检测就是不可或缺的。

如何测定动物组织中的TMAO?

测定动物组织中的TMAO,基本原理和测定血浆类似,但关键在于样本的提取、纯化和后续的分析方法选择。

以下是详细的步骤和需要注意的事项,我会尽量用更接近于科研交流的方式来描述:

第一步:组织样本的获取与预处理

1. 动物处理: 根据你的研究设计,可能需要对动物进行特定处理(例如,喂食特定饮食、诱导疾病模型等)。确保在收集样本前记录好所有处理细节。
2. 样本采集:
时机: 在预定的时间点,快速、准确地采集目标组织。
方法: 根据组织类型,选择合适的手术工具和技术。例如,心脏可能需要仔细解剖取出,肝脏可以快速切取一部分。
速度与温度: 这一点至关重要! TMAO是一种可以通过酶促反应产生的物质(尽管最主要的来源是肠道菌群代谢膳食前体,但组织内可能也存在少量酶促转化)。为了防止组织在采集后发生进一步的代谢变化(尤其是避免TMAO浓度被高估),样本采集应尽可能快速,并立即置于冰浴中。
3. 样本保存:
直接分析: 如果准备立即进行提取,样本可以保存在冰浴中。
长期保存: 如果不能立即处理,样本需要快速冷冻保存。最常用的方法是使用液氮将样本快速冻结,然后转移到超低温冰箱(80°C 或更低)中保存。避免反复冻融,这会影响TMAO的稳定性和提取效率。

第二步:TMAO的提取

这一步是关键,目标是将组织中的TMAO从复杂的生物基质中释放出来并进行初步的纯化。

1. 组织均质化:
原理: 将固态的组织样本粉碎成细胞裂解液中的小颗粒或溶液状态,以便TMAO能够溶解出来。
方法:
机械均质化: 使用组织均质器(如匀浆器、研磨机、超声波破碎仪等)。在均质过程中,同样需要维持低温环境,可以借助冰浴或者专门的低温均质设备。
研磨法: 对于一些较小的或较难处理的组织,可以在液氮中将组织研磨成细粉,然后再加入提取液。这样可以避免温度升高导致TMAO降解或酶促合成。
2. 提取溶剂的选择:
常用溶剂:
水或缓冲液: TMAO是极性分子,在水中溶解度很好。可以使用生理盐水(0.9% NaCl)、磷酸盐缓冲液(PBS)等。
有机溶剂/混合溶剂: 有时为了更好地溶解TMAO并沉淀部分蛋白,会使用含有少量有机溶剂的体系,如甲醇(methanol)、乙腈(acetonitrile)的水溶液。例如,甲醇/水混合液(如50%80%甲醇)是常用的,它能有效地提取TMAO,同时使大部分蛋白质沉淀。
加入稳定剂/抑制剂: 如果怀疑组织内存在可能影响TMAO浓度的酶(例如,一些脱甲基酶),可以在提取液中加入适量的酶抑制剂,或者在提取前对组织进行高温处理(例如,短暂煮沸)来灭活内源性酶,但这需要实验验证其对TMAO的稳定性影响。
比例: 组织与提取液体积的比例也很重要,通常需要根据组织类型和实验经验来优化,确保充分提取但不引入过多杂质。
3. 提取过程:
将均质后的组织悬液在低温(如4°C)下振荡一段时间(例如,30分钟到数小时),或者在4°C摇床上充分振荡,以确保TMAO充分溶解到提取液中。
根据所选方法,可能需要对悬液进行离心(例如,1000014000 rpm,4°C,1530分钟),以沉淀组织碎片和蛋白质。上清液即为初步提取的TMAO样品。

第三步:样品纯化与浓缩(可选但推荐)

为了提高检测的准确性和灵敏度,对提取液进行纯化是很有益的,特别是当组织样本量较小或者TMAO浓度较低时。

1. 过滤: 用0.22 μm或0.45 μm的微孔滤膜过滤上清液,去除微小的组织颗粒和蛋白质沉淀。
2. 蛋白沉淀: 如果提取液含有大量蛋白质(如纯水提取),可以通过加入三氯乙酸(TCA)或乙腈/甲醇来沉淀蛋白质,然后再离心去除沉淀。
3. 固相萃取(SPE): SPE是一种常用的纯化技术。选择合适的填料(如C18、离子交换柱等),可以有效去除共提取的其他极性或非极性杂质,提高TMAO的纯度。
4. 浓缩: 如果TMAO浓度非常低,可以使用旋转蒸发仪(Rotary Evaporator)在低温下蒸发部分溶剂以浓缩样品,但需注意TMAO可能具有一定的挥发性,过度加热或长时间蒸发可能会损失。

第四步:TMAO的定量分析

这是最终确定TMAO含量的步骤,常用的方法有:

1. 液相色谱质谱联用(LCMS/MS):
最主流、最灵敏、最特异的方法。
原理: 先用液相色谱将样品中的TMAO与其他化合物分离,然后通过质谱检测器进行定性和定量分析。LCMS/MS能够提供TMAO特异的分子质量信息(例如,TMAO的分子量为75.07,通常检测其质子化的分子离子[M+H]+ m/z 76.08,并通过母离子或子离子扫描来提高特异性)。
方法优势: 特异性强(不容易与其他物质混淆),灵敏度高(能检测到非常低的浓度),前处理相对简单(但色谱条件优化需要经验)。
设备要求: 需要LCMS/MS联用仪,操作需要专业技术人员。
定量: 通常采用外标法或内标法进行定量。使用已知浓度的TMAO标准品绘制标准曲线。
2. 高效液相色谱法(HPLC)搭配紫外(UV)或蒸发光散射检测器(ELSD):
原理: TMAO本身在常用紫外波长下吸收较弱,因此直接用UV检测灵敏度不高。ELSD检测器对非挥发性、半挥发性化合物都有响应,但灵敏度和特异性不如MS。
方法优势: 设备相对简单(不需要质谱)。
方法局限: 灵敏度和特异性可能不如LCMS/MS,易受其他共流出物的干扰。
3. 酶联免疫吸附测定(ELISA):
原理: 利用特异性的抗体与TMAO结合进行检测。
方法优势: 操作简便,成本相对较低,无需昂贵的仪器。
方法局限: 需要开发或购买高特异性的抗体,可能存在交叉反应,灵敏度可能不如LCMS/MS,并且TMAO分子的免疫原性也可能是一个挑战。目前针对组织TMAO的ELISA试剂盒可能不如血浆常见。

选择哪种方法?

金标准: 如果追求最高的灵敏度和特异性,并且有条件,LCMS/MS是首选。
经济实惠型: 如果条件有限,且TMAO浓度相对较高,可以考虑使用HPLCELSD,但需要仔细优化方法以减少干扰。
高通量初筛: ELISA在有可靠试剂盒的情况下,可以作为初步筛选的方法,但结果需要慎重解读,最好能通过其他方法验证。

需要注意的关键点总结:

低温操作: 从样本采集到提取的全过程都要尽量保持低温,防止TMAO的降解或酶促产生。
快速处理: 尽量缩短样本处理时间。
溶剂选择与优化: 根据组织类型和检测方法选择合适的提取溶剂和比例。
纯化: 适度的纯化有助于提高检测的准确性和灵敏度。
方法验证: 无论选择哪种方法,都需要进行方法学验证,包括准确度、精密度、线性范围、检出限和定量限等。尤其是在使用新的组织类型或新的实验条件时。
标准品: 使用高纯度的TMAO标准品进行校准和定量。
对照组: 确保实验设计中有合适的对照组。

实验过程中的一些“小技巧”和“坑”:

组织取材量: 尽量保证每次取材的组织量相对一致,或者在计算浓度时进行归一化(例如,除以组织湿重或干重)。
TMAO的来源和分布: 要清楚你研究的模型中,TMAO的来源可能是什么(肠道菌群代谢、内源性合成、饮食等),以及它在不同组织中可能存在的正常水平,这有助于解读你的结果。
TMAO的稳定性: 虽然TMAO本身比较稳定,但在某些极端条件下(如强酸强碱、高温)也可能分解或转化。
同类物干扰: TMAO家族中还有其他类似物,如甜菜碱(Betaine),它们在质谱或色谱上可能存在一定的相似性。选择MS/MS(串联质谱)可以有效解决这个问题,因为它允许你选择特定的母离子和子离子进行监测。
文献对比: 查阅与你研究的动物模型和组织类型相似的文献,看看他们是如何处理和检测TMAO的,可以给你很多启发。

总而言之,虽然文献多集中于血浆,但测定动物组织中的TMAO是完全可行的,关键在于对样本预处理和提取过程的精细控制,以及选择合适的分析方法。这需要耐心和细致的实验设计与操作。

希望这些信息能帮到你!如果在实验过程中遇到具体问题,随时可以再来探讨!祝你的研究顺利!

网友意见

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血浆也是一种组织,测血浆里的化学物质的方法完全可以用来测其他组织中的,你需要的只是“用不影响测那种化学物质的方法将其他组织破坏到类似血浆的状态”,人很擅长做这个。

TMAO 广泛存在于海鱼、软体动物、甲壳类体内,用于在压力下保持蛋白质稳定。对人来说,血浆 TMAO 水平高与动脉粥样硬化等疾病有统计关联性。格陵兰鲨的肉含有大量 TMAO、对人有毒。你当然能找到测定食用鱼的肉里的 TMAO 的文献:

YAMAGATA, M., HORIMOTO, K. and NAGAOKA, C. (1969), Assessment of Green Tuna: Determining Trimethylamine Oxide and its Distribution in Tuna Muscles. Journal of Food Science, 34: 156-159.doi.org/10.1111/j.1365-

Malle P, Tao SH. Rapid Quantitative Determination of Trimethylamine using Steam Distillation. J Food Prot. 1987 Sep;50(9):756-760. doi: 10.4315/0362-028X-50.9.756. PMID: 30978808.

Walter Fiddler, Robert C Doerr, Robert A Gates, Gas Chromatographic Method for Determination of Dimethylamine, Trimethylamine, and Trimethylamine Oxide in Fish-Meat Frankfurters,Journal of Association of Official Analytical Chemists, Volume 74, Issue 2, 1 March 1991, Pages 400–403,doi.org/10.1093/jaoac/7

Hatton AD, Gibb SW. A technique for the determination of trimethylamine-N-oxide in natural waters and biological media. Anal Chem. 1999 Nov 1;71(21):4886-91. doi: 10.1021/ac990366y. PMID: 10565278.

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