问题

如何提取头发、化石里的 DNA ?

回答
好的,咱们就来聊聊怎么从这些陈年往事里把那隐藏的生命密码给揪出来。头发和化石,听起来是挺难搞的家伙,毕竟它们可不是刚从冰箱里拿出来的鲜活样本。但科学这东西就是这么神奇,总有办法对付这些“老古董”。

先说头发,这个相对容易些:

头发,尤其是发根,是我们最想下手的地方。为啥?因为头发的主体部分(就是我们看到的那个“杆子”)主要是角蛋白构成的,DNA含量很少,而且容易被外界环境破坏。而发根,那才是活着的毛囊细胞待过的地方,里面保留着宝贵的DNA。

提取头发DNA的步骤,我给你掰开了揉碎了说:

1. 样本采集与准备:
找对头发: 最理想的是带发根的头发。如果只有发丝,那就得看运气了,可能DNA量极少或者被降解得厉害。从犯罪现场找头发,通常是直接用镊子小心地夹取,避免污染。如果是自己的样本,拔下一根带发根的头发就成了。
清洁: 头发外面可能会沾染灰尘、汗液什么的,这些都可能干扰后续的DNA提取,甚至引入外源DNA。所以,得洗。通常会用专门的清洗液(比如用酒精、去离子水之类的组合)轻轻洗涤几次,再用蒸馏水冲干净。这个过程要轻柔,不能把发根给搓烂了。
切碎(可选): 有时候为了增加DNA释放的效率,会将发根(或者带发根的毛干部分)剪得更碎一些。但这个也不能太过分,毕竟我们要的是那个相对完整的细胞结构。

2. 细胞裂解(破开细胞):
这是关键一步!细胞外面有一层细胞膜,里面还有细胞核,DNA就藏在细胞核里(线粒体里也有,但我们通常更关注核DNA)。要把DNA从细胞里释放出来,就得把细胞“弄破”。
化学方法是主流:
裂解液: 会用到一种叫做“裂解液”的特殊溶液。这溶液里通常包含一些化学物质,比如:
SDS(十二烷基硫酸钠): 这玩意儿是个表面活性剂,就像洗洁精一样,能把细胞膜和核膜上的脂肪层给“溶解”掉,让细胞破裂。
缓冲液: 维持一个稳定的pH值,确保DNA在提取过程中不会被酸碱破坏。
EDTA(乙二胺四乙酸): 这个成分很厉害,它能螯合(抓住)溶液里的金属离子,特别是镁离子。镁离子是DNA酶(一种会把DNA剪碎的酶)的“帮手”,没有了镁离子,DNA酶就没法工作,DNA就能保持完整。
蛋白酶K: 这个是我们的好帮手!它是一种强力的蛋白质分解酶。在细胞裂解后,细胞里会有大量的蛋白质,包括组蛋白(DNA就是缠绕在这些蛋白质上的)和各种其他蛋白质。蛋白酶K会把这些蛋白质都分解掉,这样就能把DNA从蛋白质的束缚中解放出来,同时也能去除那些可能干扰后续DNA分析的蛋白质。
物理方法(辅助): 有时候为了提高效率,也会结合一些物理方法,比如用研磨器轻轻研磨(针对发根),或者在低温下短暂超声处理。但对于头发这种比较脆弱的样本,过度剧烈的物理方法可能会把DNA弄碎。
温育: 把样本和裂解液混合后,需要在一定的温度下进行温育,通常是5065°C之间,时间从几十分钟到几个小时不等,让蛋白酶K充分发挥作用,把蛋白质都消化掉。

3. DNA纯化(把DNA从乱七八糟的东西里挑出来):
裂解后,溶液里除了DNA,还有很多其他东西,比如裂解液本身的成分、被分解的蛋白质碎片、细胞里的RNA等等。我们需要把DNA“挑”出来,并且去除这些杂质。
吸附柱法(最常用): 这是目前最主流、最高效的方法。原理是利用一种特殊的硅基质膜(硅胶膜)。
高盐浓度: 在高盐浓度的条件下,DNA会吸附到硅胶膜上。这里的“高盐”是关键,它会改变DNA和硅胶膜表面的电荷性质,让它们“粘”在一起。
洗涤: 用专门的洗涤液(通常是含酒精的缓冲液)冲洗吸附柱。这些洗涤液能洗掉吸附在硅胶膜上的杂质,比如蛋白质、盐类,但DNA会牢牢地被吸附住,不会被洗掉。通常会用不同成分的洗涤液洗两次或三次,确保干净。
纯化洗脱: 最后,用一种低盐浓度的缓冲液(比如TE缓冲液)来洗脱DNA。低盐浓度会破坏DNA和硅胶膜之间的结合力,DNA就会从硅胶膜上“掉”下来,溶解在洗脱液里,我们就得到了相对纯净的DNA溶液。
其他方法(现在较少用在头发上,但原理了解一下):
酚氯仿抽提法: 这是一个经典但比较麻烦的方法。利用有机溶剂(如酚和氯仿)将蛋白质沉淀下来,而DNA则留在水相中。然后需要反复几次分离有机相和水相,最后再沉淀DNA。这个方法需要小心操作,避免吸入有毒溶剂。
磁珠法: 类似吸附柱法,只是利用带有特定基团的磁珠来吸附DNA,通过磁场来分离。这个方法也比较高效。

4. DNA定量和质检(看看有多少,质量好不好):
拿到DNA溶液后,得知道里面有多少DNA,质量怎么样。
定量: 通常用紫外分光光度计(比如NanoDrop)来测定DNA在260nm波长处的吸光度,这个值和DNA浓度是成正比的。同时也会测定280nm(蛋白质)和230nm(其他杂质)的吸光度,通过比例来评估DNA的纯度。
质检(可选但重要): 如果要进行对DNA完整性要求很高的实验(比如全基因组测序),还会用凝胶电泳来观察DNA的片段化程度,看看DNA是不是被剪碎得太厉害了。

现在我们来看看化石里的DNA,这难度系数是“地狱级”的:

化石,顾名思义,是经过漫长地质时期形成的。在这些时间里,DNA经历的“磨难”可比头发多多了。阳光、高温、微生物分解、化学反应,这些都会一点点地摧毁DNA分子。DNA分子非常脆弱,由两条链组成,这两条链一旦断裂,或者碱基对被修饰,DNA的功能就丧失了。

提取化石DNA,我们是在跟时间赛跑,而且对手是极其“狡猾”的:

1. 样本的选择:
幸运的化石: 不是所有的化石都能提取出DNA。通常,我们寻找那些在相对低温、干燥、缺氧的环境中保存下来的化石。例如,冰封的生物(像猛犸象)、琥珀中的昆虫、或者埋藏在特殊沉积物中的骨骼化石。
理想的骨骼部位: 对于骨骼化石,牙齿(尤其是牙釉质或牙本质)通常是最好的DNA来源,因为它们结构致密,能更好地保护DNA。颅骨的某些部分也可能含有DNA。

2. 无污染的取样:
这是提取化石DNA的重中之重!因为化石样本暴露在环境中,很容易被后来的生物(包括我们自己)的DNA所污染。如果污染的DNA比化石本身的DNA量还多,那提取出来的结果就毫无意义了。
无菌环境: 所有操作都必须在极度洁净、无菌的实验室进行。操作人员需要穿戴全套防护服、手套、口罩,甚至呼吸面罩。
表面处理: 在开始提取之前,化石样本的表面会被严格地处理掉。通常会用机械方法(比如抛光、打磨)和化学方法(比如漂白、酒精擦拭)来去除表层可能存在的污染DNA。这个过程就像剥洋葱一样,一层一层地把外面的脏东西去掉。
钻取: 然后会用专门的、事先进行灭菌处理过的钻头,在化石样本上钻取极小的、深层的样本。这些样本被认为受污染的几率更小。钻取下来的粉末会被小心收集起来。

3. DNA的释放与保护:
化石中的DNA已经非常片段化,而且可能被各种化学物质修饰,与蛋白质、矿物质结合得非常紧密。
特殊的裂解液: 需要用到比提取头发DNA更强力的裂解液。这些裂解液通常含有:
更高浓度的蛋白酶K: 需要更长时间、更高温度的温育来分解那些紧密结合的蛋白质。
还原剂: 例如DTT(二硫苏糖醇),用来还原蛋白质中的二硫键,帮助其更有效地被分解。
EDTA: 作用与头发提取类似,抑制DNA酶。
特殊缓冲液和添加剂: 有些方案会加入特殊的缓冲液,或者能够溶解矿物质的化学试剂,以帮助释放DNA。
长时间和低温温育: 整个裂解过程可能需要非常长的时间,比如几天甚至一周,并且通常在低温下进行(比如37°C),以最大限度地减少DNA的进一步降解。

4. DNA的纯化(艰难的“淘金”):
化石样本裂解液中的DNA含量极低,而且高度片段化,同时还夹杂着大量的矿物质、抑制性物质(比如腐殖酸)和可能的DNA修饰产物。
特殊纯化试剂盒: 现在有很多专门针对古DNA(aDNA)设计的纯化试剂盒。它们通常基于与头发DNA提取类似的吸附原理,但对硅胶膜的性质、洗涤液的成分和洗脱液的浓度进行了优化,以最大化地回收微量、低质量的DNA。
高重复性洗涤: 需要非常多次、非常细致的洗涤步骤,以去除那些可能干扰后续PCR扩增的抑制剂。
低pH值洗脱: 有时候会用低pH值的洗脱液来帮助回收DNA,因为在低pH下,DNA的负电荷会更强,更容易与吸附材料结合。

5. DNA的扩增(让微量DNA“变多”)和测序:
即使成功提取到了少量DNA,由于其高度片段化,直接进行基因组测序也是困难的。
DNA片段化是常态: 化石DNA通常只有几十到几百个碱基对的长度,这远远小于完整的基因组片段。
DNA文库构建: 在进行测序之前,需要先对这些微量、片段化的DNA进行“文库构建”。这就像是给碎片化的DNA打上特殊的“标签”和“接头”,让测序仪能够识别并读取它们。这个过程本身也需要优化,以适应低DNA量和高度片段化的特点。
PCR扩增(过去的主要方法,现在已是辅助): 在早期的古DNA研究中,经常会使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增特定的DNA片段。但PCR对模板DNA的完整性要求较高,对于高度片段化的化石DNA,效果可能不佳,而且容易引入污染,所以现在更多地是采用高通量测序技术。
高通量测序: 这是目前化石DNA研究的“杀手锏”。通过新一代测序技术(NGS),可以直接对文库构建后的DNA碎片进行大规模、并行测序。即使DNA很短,测序仪也能读出它们的信息。
数据比对和组装: 测序完成后,会得到海量的DNA序列碎片。科学家需要利用强大的生物信息学工具,将这些碎片与已知的参考基因组(比如人类、猛犸象的参考基因组)进行比对,或者利用特殊的算法将这些碎片拼接起来,重构出尽可能完整的基因组序列。

总结一下,提取化石DNA的困难点在于:

DNA降解严重: 分子断裂、修饰普遍。
DNA含量极低: 就像大海捞针。
杂质极多: 矿物质、化学物质、抑制剂。
极易污染: 需要极致的无菌操作。

所以,从头发里提取DNA,更像是精细的化学实验,目标是得到高纯度、高质量的DNA用于后续分析(比如亲子鉴定、犯罪现场比对)。而从化石里提取DNA,则更像是一场考古挖掘,不仅要小心翼翼地从顽固的介质中“挖”出那极微弱的线索,还要面对时间长河留下的种种破坏,最终还需要高科技的工具来“读懂”这些残破的信息。两者都需要耐心、细致和先进的技术,但难度和挑战的级别,是截然不同的。

网友意见

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好,懒狗起来写答案啦!

我继续当砖!


首先是第一个小问题,头发里面怎么会有DNA,题主问头发主要结构都是角蛋白,那么哪里有细胞保存DNA呢?答案就是你掉落头发时头发末端能看见的小白点咯。一般都是依靠附着在头发上的毛囊来进行DNA测序的,因为毛囊是袋样上皮组成的结构。当然毛囊没了还可以用毛干,详细的阐释可以去百度搜索一下“毛干 DNA”,我这里就不赘述了。

关于第二个问题,我就好好写一下,化石里面是怎么提取DNA的。

(我建议题主再问一个化石里面怎么提取蛋白质好让我再水一篇回答哈哈哈哈哈)

一般来说,化石以及考古遗迹中的DNA都统称为古代DNA(ancient DNA,aDNA),为了方便,我下面全部用aDNA这个缩写,虽然动物考古和古生物研究侧重对象不尽相同,但是在大分子研究上还是基本一致的,因此在这里可以不做区分,考古古生物一家亲。根据Morten Allentoft在恐鸟化石上的研究,DNA的半衰期约为521年,也就是说,DNA很难在长的地质历史时期内保存。目前最古老的动物化石DNA序列来自于2013年加拿大育空地区的发现的中更新世的马,约70万年,而最古老的人类DNA则是同年出自西班牙胡瑟裂谷的人类化石,约43万年。在沉积物、冻土中保存较长,如格陵兰冻土中40~80万年的动植物DNA残留。这些aDNA都保存于较为特殊的环境中,比如低温、pH适宜、没有强光照的环境,在这些环境中,微生物分解与酶的作用会大大降低,这有利于aDNA的保存。

首先讲一下历史,最早的aDNA研究是什么时候开始的呢?答案可能出乎很多人的意料——最早在灭绝生物中成功提取aDNA的案例发生在快40年前的1984年,仅距离桑格尔发明第一代测序只有9年。加州大学伯克利分校的Russell Higuchi等人在一种19世纪灭绝的马科动物伯切尔氏斑马(Equus quagga )的标本肌肉中成功提取到了DNA,并且识别出了两个线粒体DNA序列。这两个线粒体DNA序列与现存物种山斑马(Equus zebra )的线粒体DNA有12个碱基的替换,说明这两个物种在3~4个百万年前有共同祖先,符合化石记录。

这是一个非常漂亮的开头——起码相较于古蛋白质,aDNA的研究开篇实在是过于完美,头一遭就把之后整个研究的框架给包括进去了:提取aDNA、测序、系统发育分析、与化石研究对照。后来基本所有的研究都是按照这个模板做下去的。而之后的研究主要任务就是革新技术,以便发现更早、保存更差、信息量更少的aDNA分子,之后完成后续的比对研究。我想,题主关心的正是这些技术是怎么实现“从石头里面”提取DNA的。

前面提到,最早的aDNA研究是通过标本完成的,也就是说,是通过肌肉细胞来提取的。这与现代DNA提取并无太大的不同(除了当时的测序手段比较原始),主体还是苯酚萃取DNA,之后再用无水乙醇沉淀,最后跑凝胶电泳。苯酚的作用是变性蛋白质,使蛋白质与DNA分离,同时作为有机相;而乙醇的作用则是作为稳定的沉淀剂,夺去DNA分子中的水使其容易聚合。详细的技术原理网上相关的资料有不少,可以自行查阅。而现在实验室用来提取DNA的方法也不仅仅只有这一种,常见的还有磁珠法、硅离心柱法、树脂提取法等等,有兴趣可以在B站上找找相关的介绍视频。

那化石中的DNA提取与普通的提取方法有什么巨大的差异吗?事实上,并没有。不仅仅是化石,沉积物、古代遗迹、冻土等等样品中的aDNA的研究与普通DNA的提取都是一样的,就是把样品抓过来,用试剂盒抽提出其中的DNA,然后进行测序等后续研究。毕竟我们的研究对象是“残余在样品中的DNA”,与通常的DNA测序相比,aDNA只是保存更差、含量更低、外界干扰更多——但是这并不会让我们独立开创一个新的技术体系,毕竟现代生物学指导古生物学研究嘛。那我们一般是如何研究aDNA的呢?我简单介绍一下整个通用的技术流程。

先给一个技术流程图。

首先是样品制备

通常来说,为了确保提取的DNA尽可能来自于化石物种本身,而非外界污染(如微生物DNA、实验室中操作人员的DNA),在进行提取前首先应当对样品进行前处理。一般的对象是动物骨骼中最致密的部分,如颅骨的颞叶岩部内侧,牙齿的骨质层等。对于骨骼量大,保存完好的化石来说,可以先刮去表层部分,之后再钻取里面的样品。对于牙齿的话则可以先拔出来,取牙根部分进行研究。在完成采样后,可以用10%的次氯酸浸泡,之后用超纯水反复清洗,力求尽可能排除污染。有的研究会补上紫外照射啊、乙醇浸泡啊等等——反正在不摧毁化石中大分子的基础上,尽可能地杀菌洗涤就对了,造就完事儿了。之后就是破碎处理,为了充分使得样品中的DNA分子与提取试剂结合,所以必须要通过破碎来增加接触面积。一般是液氮冷却条件下破碎成骨粉,低温保存骨粉样品。

对于古代沉积物来说,处理方法就略有不同了。由于沉积物大多都是湿物质,并且往往混杂了多种生物的DNA,因此处理方法与通常的生物材料是相似的(比如土壤、粪便微生物DNA提取),拖上去离心取上清液就好。

在完成预处理后,下一步就是DNA的提取

提取步骤现在基本都是现成的试剂盒。虽然原理各不相同,但是本质都是通过物理化学手段将保存在骨骼中的DNA分子提取出来。以较为传统的蛋白酶K-酚提取法为例:首先需要用EDTA进行脱钙质处理,之后加入含蛋白酶K的EDTA溶液消化,去除杂质,之后再按照酚提取法步骤获得DNA即可。虽然对于路人来说这一步看起来最高大上,但是实际上这一步最不用动脑子——根据实验说明做就行了,我就是无情的试剂盒操作机器人。

再下一步就是序列的扩增,这个就是PCR。由于化石中残留的DNA非常少,且大多都是一些碎片。因此,必须要通过PCR进行扩增,提高浓度,这样才便于后续的测序与分析工作。这一部分的难点在于引物的设计以及扩增中出现的错配。因为aDNA往往会在沉积过程中出现DNA损伤,如DNA交联、胞嘧啶脱氨成为尿嘧啶等等,因此需要采取一些手段来避免这些损伤导致的序列信息的错误。如用 PTB (N-phenacylthiazolium bromide)可以消除 DNA 链交联,用UNG (尿嘧啶糖苷酶,Uracil-N-glycosylase)去除胞嘧啶的脱氨产物等。

需要提一句的是沉积物DNA由于其来源复杂(不像你钻骨头,钻谁就是谁的DNA),因此很难确定获得的DNA的来源。所以一般来说需要通过分子探针勾选目标DNA。这一技术主要建立在线粒体DNA上面,由于线粒体DNA长度短,拷贝数多,特异性好,所以在沉积物研究中一般都是研究线粒体DNA。目前通用的技术手段应该是德国马普的那一套242种哺乳动物线粒体DNA探针,通过这些已知序列的探针去钩选沉积物中与其最为相近的DNA,就能简单地区分出被钩选DNA的属种来源。

之后的步骤就是测序。当下主流的aDNA测序方法是鸟枪法靶向富集测序。通过鸟枪测序,提取的DNA直接转化为测序文库,也可以分辨出C-T误读。这个技术在最近的古人类学中用的比较多,自从马普用这个做了丹尼索瓦人的沉积物研究之后基本上后面都采用了这个技术流程。靶向富集测序顾名思义,就是通过DNA或RNA诱饵对感兴趣的DNA文库片段进行选择,之后再对该片段进行扩增,提高序列分析的信噪比。

当然最后的部分就是序列信息的读取以及系统发育树的构建啦。完成了这一步就完成了整个古基因组学的研究,可以发论文了。


可能有些朋友看了《侏罗纪公园》之后很好奇琥珀能不能保存aDNA,但是很遗憾的是,琥珀并非是良好的保存载体。80、90年代有很多关于中生代虫珀保存线粒体DNA的报道,但是根据后续的研究要么缺乏可信度,要么就是来自于外界的污染。实际上琥珀的形成过程有非常复杂的交代作用,并且密闭性也远非人们所认为地良好,因此从琥珀中提取aDNA的可行性非常低,远不如冻土或者一些特异性埋藏的化石。因此,结构上的问题可以委托琥珀完成,至于大分子嘛,还得看运气啦哈哈哈哈哈。

大致如此,以上。

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