RNA的提取中为什么要先加异丙醇再加乙醇？

好的，咱们聊聊RNA提取里为什么会先用异丙醇再用乙醇。这背后可不是瞎操作，是有科学道理的，而且跟RNA的性质、离心分离的效率都有关系。

核心目的：沉淀RNA，并且让它尽可能沉淀得干净

RNA提取的核心步骤之一就是把RNA从复杂的样品溶液里沉淀出来，让它变成一团固体，这样我们才能把它分离出来，去除掉那些不需要的杂质（比如蛋白质、DNA、盐类等等）。异丙醇和乙醇都是用来实现这个目的的“沉淀剂”。

为什么先异丙醇，后乙醇？这涉及到“溶解度”和“沉淀效率”

你可以把异丙醇和乙醇想象成是“不同脾气”的溶剂。它们溶解DNA和RNA的能力以及沉淀这些核酸的能力是有区别的。

1. 异丙醇：强力“拽出”RNA

高浓度下，异丙醇对RNA的溶解性较低：异丙醇，尤其是高浓度（通常是70%100%），对于RNA来说是一个非常有效的沉淀剂。它能大大降低RNA在溶液中的溶解度。
“吸水”能力强，创造沉淀环境：异丙醇和水混在一起时，会形成一个更强的“脱水”环境。RNA分子上有大量的羟基（OH）基团，这些基团容易和水分子形成氢键，使得RNA保持溶解状态。异丙醇的加入，就像是把水分子“抢走”了一部分，使得RNA分子之间的氢键作用力增加，分子间的范德华力也更容易主导，从而促使RNA分子聚集起来，脱离溶液形成沉淀。
同时沉淀DNA和蛋白质等：值得注意的是，高浓度的异丙醇在沉淀RNA的同时，也会比较有效地沉淀DNA、一部分蛋白质以及一些多糖等杂质。虽然我们最终目标是RNA，但在这个早期步骤，把大部分大分子物质一起沉淀下来，有助于后续的分离。

2. 乙醇：巩固沉淀，洗去盐类杂质

提供更温和但有效的沉淀环境：乙醇，特别是70%75%的乙醇，通常用于洗涤RNA沉淀。为什么不是直接用高浓度乙醇洗？因为高浓度乙醇虽然沉淀能力强，但它也能溶解一些在核酸沉淀过程中夹带的盐类（比如用来促进沉淀的钠离子、胍盐等）。如果直接用高浓度乙醇洗涤，可能会把这些盐类也“带走”，而这些盐类对RNA的稳定性很重要。
洗去多余的盐类，但保留RNA： 70%75%的乙醇溶液，一方面，它仍然能保持RNA的沉淀状态，因为RNA在这样的浓度下溶解度依然很低，不会被重新溶解；另一方面，它能够有效地溶解并洗去那些与RNA结合在一起但又不是RNA本身的小分子杂质和过多的盐类。这些盐类如果不洗掉，可能会干扰后续的RNA分析（比如RTPCR）。
“二次洗涤”或“重悬浮”后再次沉淀（视具体方案而定）：在一些提取方案中，异丙醇沉淀后，会用乙醇进行洗涤。这个洗涤过程其实也是在“巩固”RNA的沉淀形态，并且去除杂质。

总结一下顺序背后的逻辑：

异丙醇先上场：它是一个更强的“诱导剂”，能够强有力地将RNA（以及一些其他大分子）从溶液中“拽”出来，形成一个相对粗糙的沉淀。它的目标是尽可能多地把RNA集中起来。
乙醇后跟着：在异丙醇完成了“粗加工”后，乙醇（通常是较低浓度，如70%75%）就登场了。它的作用更像是一个“精加工”和“清洁工”。它既能保持住已经沉淀下来的RNA不散架，又能把附着在RNA沉淀上的那些“不请自来”的盐类、小分子杂质给洗掉，确保我们最终得到的RNA足够纯净，便于后续的实验分析。

打个比方：

想象一下你要从一堆沙子里找出一些小金粒。

异丙醇就像是你用一个大筛子，一下子把大部分沙子和一些大点的石块都过滤掉了，把可能含有金粒的沙土堆到一起。
乙醇就像是你再用一个小筛子或者水冲洗，把大部分细小的泥土冲掉，但金粒留在了里面。这样你得到的金粒就更纯净了。

所以，先异丙醇后乙醇（或者用乙醇洗涤异丙醇沉淀的RNA），是一种优化沉淀和纯化效率的策略，确保我们能得到质量更好的RNA。当然，具体的试剂浓度和操作步骤会根据不同的RNA提取试剂盒或方案有所调整，但核心原理是相通的。

网友意见

抽RNA如果希望得率高，可以先加入NaCl或醋酸铵，再加异丙醇，-20度醇沉过夜。第二天离心去上清，用乙醇洗两遍。

下面说原理：

1. 把溶液调成高盐：

盐离子和RNA抢水，破坏RNA的水化层，导致RNA和水的亲和力降低，方便醇沉。

如果你的RNA少，醇沉不出来，推荐加盐。

有次体外转录RNA，手边RNase free的高盐溶液用完了，省了这步，就没醇沉出RNA。第二天重做，加了盐，RNA就出来了。

2. 先用异丙醇醇沉：

异丙醇和RNA抢水，破坏RNA的水化层，导致RNA析出沉降。

异丙醇羟基多，抢水能力大于乙醇，醇沉效果更好。

但是，异丙醇挥发性远远低于乙醇，很难晾干。

3.后用乙醇洗两遍：

乙醇可以带走高盐留下来的盐离子，带走挥发不干净的异丙醇，带走醇沉时同样析出的蛋白质和脂类。

乙醇挥发快，很快就能干，是异丙醇比不了的优点。

具体步骤，可参考NEB E2050说明书的RNA纯化。

评论区有人说搜不到，可以百度NEB，进入NEB主页，搜索E2050，进入产品页，下载PDF。

具体步骤和原理，也可参考分子克隆指南。尽管这书特别有用，不过我猜很多人都没兴趣翻这本大部头。

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