为什么细菌自己的DNA不会被自己的cas9切断？
细菌之所以能够安然无恙，这背后藏着一个精巧且高效的免疫系统，叫做 CRISPRCas 系统。这套系统可不是随随便便就能切割基因的，它有非常严格的“身份验证”机制。我们来一步一步拆解一下，看看细菌是如何保护自己的。
CRISPRCas 系统：细菌的“分子剪刀”和“身份识别系统”
首先，要理解为什么细菌不被切，我们需要先知道 CRISPRCas 系统是怎么工作的。你可以把这个系统想象成一个双人组合：
1. CRISPR 阵列 (CRISPR array)：这是细菌基因组里的一段特殊区域，你可以把它想象成一个“记忆库”或者“通缉犯名单”。它由一系列短的、重复的 DNA 序列（称为 Repeats）和中间插入的、来自入侵者（比如病毒或质粒）的 DNA 片段（称为 Spacers）交替组成。每个 Spacer 都像是一个被记录下来的入侵者 DNA 的“指纹”。
2. Cas 蛋白 (CRISPRassociated proteins)：这是一组负责执行切割任务的蛋白，其中最重要的就是我们常说的 Cas9 酶。Cas 蛋白会与 CRISPR 阵列转录出的 RNA 分子（称为 crRNA 或 tracrRNA）结合，形成一个复合物。
那么，这个系统是如何工作的呢？
“学习”阶段（适应期 Adaption）：当病毒或外源 DNA 侵入细菌时，细菌的某些 Cas 蛋白（通常是 Cas1 和 Cas2）会识别并剪切这些外源 DNA 的一小段，然后将这段 DNA 片段“整合”到 CRISPR 阵列中的某个 Repeats 之间，成为一个新的 Spacer。这就好像是细菌把外来 DNA 的“照片”存进了自己的记忆库。
“识别与攻击”阶段（干扰期 Interference）：当同一种病毒或外源 DNA 再次侵入时，细菌会从 CRISPR 阵列中转录出包含相应 Spacer 的 RNA 分子。这个 RNA 分子会与 Cas9 等 Cas 蛋白结合，形成一个 RNA引导核酸酶（guide RNAprotein complex）。这个复合物就像一把装有特定“地图”的精密“剪刀”。
切割：这个 RNA蛋白复合物会在细胞内游走，寻找与自己携带的 Spacer RNA 序列互补的 DNA 序列。一旦找到匹配项（也就是入侵者的 DNA），Cas9 酶就会沿着这个“地图”准确地在入侵者 DNA 的特定位置进行切割，从而使其失去活性，保护细菌自身。
细菌是如何避免“自残”的？关键在于“PAM”和“自我豁免”
现在我们知道整个流程了，那为什么细菌自己的基因不会被这个系统误伤呢？主要有两点关键的保护机制：
1. PAM 序列的识别限制
这是最核心、最直接的保护机制。
PAM 的作用：Cas9 酶本身并不是只根据与 guide RNA 配对的靶序列来切割 DNA 的。它还有一个非常关键的“僚机”，叫做 PAM (Protospacer Adjacent Motif)。你可以把 PAM 看作是 Cas9 酶切割的“保险杠”或者“触发信号”。在 CRISPR 阵列的 Spacer 序列的邻近位置（通常紧挨着 Spacer 序列的一侧），会有一个非常短、但特定的 DNA 序列基序，这就是 PAM。
工作原理：当细菌的 guide RNACas9 复合物找到与 guide RNA 配对的 DNA 序列时，它不会立刻切割。它会先检查这个靶序列的旁边是否有正确的 PAM 序列。只有当匹配的靶序列旁边存在正确的 PAM 序列时，Cas9 才会激活并进行切割。
细菌自身的 DNA 如何规避？
PAM 的不在位：更重要的是，在细菌自身的基因组中，大部分的 CRISPR 阵列的 Repeats 区域并没有形成与 Spacer 序列匹配的 PAM 序列，或者形成的 PAM 序列与入侵者 DNA 中常见的 PAM 不同。
Spacer 序列的独特性：CRISPR 阵列中的 Spacers 是从入侵者 DNA 中“采集”来的。这意味着，Spacers 本身就携带着入侵者 DNA 特有的序列信息。细菌的 CRISPR 阵列在设计上，通常不会包含与自身基因组中某个重要的、且含有正确 PAM 的区域完全相同的“自我记录”信息。如果细菌的基因组中恰好存在一个与 Spacer 序列高度相似且紧邻正确 PAM 的区域，那么理论上就有被切的风险。但大自然在长期的进化中，已经让细菌的 CRISPR 阵列与自身基因组的匹配度保持在一个低到可以忽略不计的水平。
PAM 的重要性：有些 CRISPR 系统（比如常见的 II 型系统中的 Cas9）对 PAM 的识别非常严格，如果 PAM 序列不匹配，即使 guide RNA 与靶 DNA 序列完美配对，Cas9 也不会切割。这就是为什么细菌可以安全地拥有与 Spacer 序列相似的 DNA，只要这些 DNA 的旁边没有那个关键的 PAM 信号。
你可以这样理解： guide RNA 就像是你给 Cas9 的“地址”，而 PAM 就像是这个地址旁边的“门牌号”。即使你找到了正确的街道（匹配的靶序列），如果门牌号不对，保安（Cas9）也不会让你进门（切割）。
2. “自我豁免”机制 (Selftargeting immunity)
除了 PAM 的限制，还有更深层次的机制确保细菌不会切割自己的 DNA。
缺失 PAM 的基因组区域：如上所述，细菌自身的基因组，尤其是那些在 CRISPR 阵列中没有对应 Spacer 记录的区域，往往缺乏 CRISPR 系统所识别的特定 PAM 序列。
CRISPR 阵列的独特结构：CRISPR 阵列本身就是细菌用来存储“入侵者信息”的。这些 Spacers 是从入侵者基因组中提取的。细菌的自然选择压力会倾向于那些能够高效识别并摧毁外来 DNA 的系统，同时又不会误伤自身基因组的个体。因此，那些包含了与自身关键基因序列高度相似且紧邻 PAM 的 Spacer 的细菌，很可能在早期就被筛选掉了（因为它们容易发生自残）。
Spacer 的长度和多样性：虽然 Spacers 可以包含与宿主基因组相似的序列，但它们通常相对较短（2040个核苷酸），并且很多时候，它们是从病毒或质粒的“非编码区”或“低拷贝区”提取的。即便如此，如果真的发生了完全匹配且有 PAM 的情况，细菌可能还需要依赖其他机制。
其他辅助蛋白：某些 CRISPR 系统还需要其他的辅助蛋白（如 tracrRNA in Type II CRISPR systems）才能激活 Cas9。这些辅助蛋白的结合可能也受到某些条件限制，或者它们与 guide RNA 的形成过程本身就有一定的调控，确保在细胞内部不会轻易形成能够攻击自身基因组的活性复合物。
细菌 DNA 的修饰：虽然不是所有细菌都采用这种方式，但一些研究表明，细菌的 DNA 可能存在某些修饰（如甲基化），这些修饰有时会干扰 Cas9 的识别或切割，尽管这不如 PAM 机制普遍。
总结一下，为什么细菌自己的 DNA 不会被切割，核心在于两道防火墙：
1. PAM 识别：Cas9 只会在找到匹配的靶序列旁边存在正确 PAM 信号时才切割。细菌自身的基因组中，大部分关键区域缺乏这种关键的 PAM 信号，或者这些信号与 CRISPR 阵列中的 Spacer 不匹配。
2. 进化选择：细菌在漫长的进化过程中，已经形成了能够平衡外来 DNA 识别能力和自身 DNA 安全性的 CRISPR 系统。那些含有会误伤自身的 Spacer 的个体，往往难以生存，因此拥有有效 CRISPR 系统的细菌种群得以繁衍。
简而言之，细菌的 CRISPRCas 系统就像一个高度定制化的武器库，它使用的“弹药”（guide RNA）是针对特定“敌人”（入侵者 DNA）制作的，并且这个武器本身（Cas9 酶）还有严格的“使用说明”（PAM 识别），确保它只会攻击那些被明确标记为“敌人”并且带有正确“识别码”的目标。
网友意见
这个问题还不错。
确实有很多从事CRISPR研究的人不太注意得到这方面的机制，因为现在所谓做CRISPR大多数都在搞工程化应用，对CRISPR作为免疫系统的机制研究不太关注。
已经记录到CRISPR阵列的gRNA序列为什么不会攻击CRISPR阵列自身就不细说了，对II型CRISPR系统而言主要是因为CRISPR阵列上没有PAM。那其实真正的问题是CRISPR系统为什么不会从自己基因组上截取protospacers放到CRISPR阵列里。“Cas1/2依赖于PAM来确定是不是外源DNA”这句话是不准确或者说不对的。
其实个问题有点儿意思的原因在于，这关系到CRISPR与细菌其它防御系统之间的合作问题。目前的模型是CRISPR与RecBCD系统合作进行敌我识别。
首先，细菌采集“原间隔片段”（不知道protospacers这么翻译好不好）的这个步骤叫做“CRISPR适应”。在自然条件下，是有一定概率从自己基因组上采集原间隔片段的，只是这个概率没有高到整个种群活不下去的程度。另外需要注意，CRISPR阵列中出现染色体上的序列，不等于这个序列来自染色体，比如发现一些mobile genetic element的同源序列，有可能是这些序列整合到染色体上之前就被CRISPR系统记录了。
不是所有的CRISPR系统都依赖PAM。题主问的最经典的II型CRISPR系统确实是PAM依赖型（包括采集原间隔片段），因此PAM一定程度上扮演了防止自免疫的角色，但显然不是一种广泛发挥作用的机制，甚至在CRISPR适应这一步不是主要起作用的机制。
PAM并不是CRISPR系统识别敌我的全部，Cas1/Cas2复合体采集原间隔片段的机制非常复杂，一项Nature上发表的研究：Levy, A., Goren, M., Yosef, I.et al. CRISPR adaptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA.Nature 520,505–510 (2015) 第一次建立了一种说得通的模型来解答原间隔序列采集的“敌我”偏好性问题。
这篇文章讲了一件事，作者在E. coli 里发现，Cas1/Cas2对原间隔片段的采集依赖于DNA双链断裂和降解，Cas1/2复合体从RecBCD（大肠杆菌另外一种免疫机制，同时是自身染色体DNA同源重组修复机制的一部分）降解双链DNA末端的中间产物中获取原间隔片段。现在我们知道其中RecBCD发挥的解旋作用是必要的，降解作用则可能可以被其它机制弥补。
很多噬菌体的DNA本身就是线性的，有暴露的双链DNA末端，所以容易在RecBCD降解它的过程中被Cas1/2复合体截取原间隔片段。
外源质粒因为复制频率高，有大量复制叉，而DNA复制时容易出现双链断裂，所以也很容易被CRISPR系统截取。
而细菌基因组正常情况下没有大量暴露的双链DNA末端，在复制过程中出现双链DNA断裂时，也有一定机会被CRISPR系统截取，但是概率小得多。
另外，RecBCD在降解线性DNA时，本身也有敌我识别机制，这种机制被CRISPR系统利用了。
DNA上有一种特征序列叫做Chi序列，这种序列简单说可以看成是RecBCD处理DNA方式的一个切换信号，可以把RecBCD的功能从降解DNA转变为DNA修复，同时也是细菌用来保护自己的。在细菌染色体上，大量存在Chi序列，可以指示RecBCD停止消化自己的染色体，进而将双链DNA断裂修复，这样也就等于阻止了CRISPR系统截取染色体上的DNA片段。而外源DNA很少有Chi序列，于是在被RecBCD降解的过程中就为CRISPR系统截取原间隔片段提供了大量原料。
最后，凡事都有例外，有些细菌是没有RecBCD系统的，有可能是Cas4客串了类似的角色，不过Cas4的主要职责现在来看还是确保protospacer和PAM的关联。
还有一个有趣的问题是Cas9本身扮演的角色，在II型CRISPR系统中，Cas9也参与了原间隔片段的截取，而且会影响DNA截取对象的偏好。这个机制目前不清楚，猜测是Cas9非特异性的DNA内切酶活性在Cas9过表达时可能会制造额外的DNA双链断裂。
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