样本冻存在-80℃冰箱一年，这样的标本检测细胞因子是否能检测出来呢？
将样本在80℃冰箱中冻存一年后，检测细胞因子是否能检测出来，理论上是有可能检测出来的，但成功率会受到多种因素的影响，并且细胞因子本身的稳定性是关键。
下面我们来详细讲解其中的原理、影响因素以及需要注意的事项：
一、 细胞因子及其稳定性
细胞因子 (Cytokines) 是一类由细胞分泌的小分子蛋白质，在免疫调节、炎症反应、细胞生长、分化等过程中发挥重要作用。它们包括白细胞介素 (ILs)、肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素 (IFNs)、集落刺激因子 (CSFs) 等等。
蛋白质的稳定性： 蛋白质是复杂的生物大分子，其三维结构对功能至关重要。蛋白质的稳定性容易受到多种因素的影响，包括：
温度： 高温会使蛋白质变性失活，低温可以减缓许多化学反应和酶促降解。
冻融循环： 反复的冻结和融化过程会破坏细胞结构，导致细胞内物质释放，也可能改变蛋白质的构象。
化学环境： pH值、盐浓度、氧化还原状态等都会影响蛋白质的稳定性。
酶促降解： 样本中可能存在的内源性蛋白酶会在特定条件下继续降解蛋白质。
聚集： 蛋白质在冻存过程中可能发生聚集，影响其可检测性。
二、 80℃冻存一年对细胞因子的潜在影响
优点：
减缓降解： 80℃的极低温可以显著减缓大多数细胞因子的化学降解和酶促降解速率。相比于20℃或室温，其保存效果要好得多。
抑制微生物生长： 在此温度下，几乎所有微生物都无法生长，从而避免了因微生物污染造成的样本降解。
潜在的缺点和挑战：
冻融损伤： 即使是单次冻结也可能对细胞内物质（如果样本是细胞裂解液）或细胞膜（如果是细胞悬液）造成物理损伤。如果样本在冻存前或冻存过程中经历了多次冻融循环，损伤会更严重。冰晶的形成会刺破细胞膜，释放出细胞内的蛋白酶，这些蛋白酶可能在解冻后迅速降解细胞因子。
蛋白质变性/构象改变： 尽管低温可以延缓，但长期的低温暴露也可能导致蛋白质缓慢的构象变化，从而影响抗体与细胞因子结合的效率，最终影响检测结果的准确性。
聚集 (Aggregation)： 细胞因子在低温或冻融过程中可能发生聚集，形成大分子复合物。这些聚集体可能无法被检测方法有效识别，或者检测信号减弱。
样本基质效应： 样本中存在的其他物质（如脂质、盐、细胞碎片等）也可能与细胞因子发生相互作用，影响其稳定性或检测。
冻存前的处理： 如果样本在采集后没有及时处理（例如，没有及时离心去除细胞碎片或血小板，特别是对于血浆样本），样本中的蛋白酶活性可能在冻结前就已开始降解细胞因子。
三、 样本类型对检测结果的影响
不同类型的样本对冻存的耐受性不同，这也会影响细胞因子的检测：
血浆 (Plasma)： 通常含有较多的蛋白酶，因此血浆样本的细胞因子稳定性相对较低。如果血浆采集后未及时离心，血小板中的颗粒酶会释放出来，显著降解细胞因子。即使及时离心，也存在潜在的降解风险。
血清 (Serum)： 血清是血浆去除纤维蛋白和凝血因子后的液体。相比于血浆，血清中的凝血酶活性较低，理论上稳定性会好一些。但同样存在其他蛋白酶的降解问题。
细胞裂解液 (Cell lysates)： 如果细胞在裂解过程中释放了蛋白酶，并且这些酶没有被有效抑制（如添加蛋白酶抑制剂），细胞因子会迅速降解。裂解液的配方和处理过程至关重要。
细胞培养上清液 (Cell culture supernatant)： 如果细胞培养过程正常，且上清液采集后及时冻存，其细胞因子稳定性相对较好。但同样需要注意细胞本身的活性以及上清液中可能存在的少量蛋白酶。
四、 检测细胞因子的方法
目前主流的细胞因子检测方法包括：
ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay)： 一种常见的定量检测方法，依赖于特异性抗体与细胞因子结合。ELISA的灵敏度和特异性较高，但对样本的稳定性有一定的要求。
Luminex 平台 (Multiplex Immunoassay)： 可以同时检测多种细胞因子，效率高。同样依赖于抗体抗原的结合。
流式细胞术 (Flow Cytometry)： 可以检测细胞表面或细胞内的细胞因子，对于检测特定细胞亚群的细胞因子表达很有帮助。
质谱法 (Mass Spectrometry)： 可以直接检测蛋白质，但目前在检测低丰度细胞因子方面应用相对较少。
这些检测方法对蛋白质的完整性和构象都有一定要求，蛋白质的降解或变性都会影响检测的准确性。
五、 结论与建议
理论上可能检测到： 80℃冻存一年有很大可能仍然可以检测到一些相对稳定的细胞因子，但成功率和检测到的浓度水平会因多种因素而异。
成功率受多种因素影响： 样本类型、采集和处理过程（尤其是冻结前处理）、冻融次数、以及细胞因子本身的稳定性是决定能否成功检测的关键。
需要谨慎解读结果： 即使检测到了，也需要谨慎解读结果，因为长期的冻存可能已经导致一部分细胞因子降解或构象改变，检测到的浓度可能低于实际的原始浓度，或者存在假阴性。
最佳实践：
优先检测新鲜样本： 如果可能，尽量使用新鲜采集的样本进行检测。
妥善处理和冻存：
样本采集后应尽快离心（特别是血浆和血清），并移除上清。
分装样本至小体积冻存管，避免反复冻融。
在80℃进行长期冻存。
如果样本中可能存在蛋白酶，应在裂解或采集上清时添加适当的蛋白酶抑制剂Cocktail。
进行对照实验： 如果条件允许，可以同时检测一部分新鲜样本和冻存样本，作为比对，以评估冻存对检测结果的影响。
选择高灵敏度的检测方法： 使用灵敏度高的ELISA试剂盒或其他检测方法可以提高检测到低浓度细胞因子的几率。
评估关键细胞因子： 一些细胞因子（如IL1β, TNFα）相对不稳定，而另一些（如IL6, IL10）可能更稳定一些。在实验设计时需要考虑这一点。
总结：
样本在80℃冰箱冻存一年后，检测细胞因子是有可能检测出来的，但不能保证一定能检测到，并且检测结果的定量准确性可能会受到影响。 这是因为虽然80℃能显著减缓降解，但长期的冻存过程仍然可能导致细胞因子的部分降解、变性或聚集。因此，在进行此类检测时，需要对样本的原始质量、处理过程以及检测结果的潜在局限性有充分的认识。在条件允许的情况下，使用新鲜样本总是更优的选择。
下面我们来详细讲解其中的原理、影响因素以及需要注意的事项：
一、 细胞因子及其稳定性
细胞因子 (Cytokines) 是一类由细胞分泌的小分子蛋白质，在免疫调节、炎症反应、细胞生长、分化等过程中发挥重要作用。它们包括白细胞介素 (ILs)、肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素 (IFNs)、集落刺激因子 (CSFs) 等等。
蛋白质的稳定性： 蛋白质是复杂的生物大分子，其三维结构对功能至关重要。蛋白质的稳定性容易受到多种因素的影响，包括：
温度： 高温会使蛋白质变性失活，低温可以减缓许多化学反应和酶促降解。
冻融循环： 反复的冻结和融化过程会破坏细胞结构，导致细胞内物质释放，也可能改变蛋白质的构象。
化学环境： pH值、盐浓度、氧化还原状态等都会影响蛋白质的稳定性。
酶促降解： 样本中可能存在的内源性蛋白酶会在特定条件下继续降解蛋白质。
聚集： 蛋白质在冻存过程中可能发生聚集，影响其可检测性。
二、 80℃冻存一年对细胞因子的潜在影响
优点：
减缓降解： 80℃的极低温可以显著减缓大多数细胞因子的化学降解和酶促降解速率。相比于20℃或室温，其保存效果要好得多。
抑制微生物生长： 在此温度下，几乎所有微生物都无法生长，从而避免了因微生物污染造成的样本降解。
潜在的缺点和挑战：
冻融损伤： 即使是单次冻结也可能对细胞内物质（如果样本是细胞裂解液）或细胞膜（如果是细胞悬液）造成物理损伤。如果样本在冻存前或冻存过程中经历了多次冻融循环，损伤会更严重。冰晶的形成会刺破细胞膜，释放出细胞内的蛋白酶，这些蛋白酶可能在解冻后迅速降解细胞因子。
蛋白质变性/构象改变： 尽管低温可以延缓，但长期的低温暴露也可能导致蛋白质缓慢的构象变化，从而影响抗体与细胞因子结合的效率，最终影响检测结果的准确性。
聚集 (Aggregation)： 细胞因子在低温或冻融过程中可能发生聚集，形成大分子复合物。这些聚集体可能无法被检测方法有效识别，或者检测信号减弱。
样本基质效应： 样本中存在的其他物质（如脂质、盐、细胞碎片等）也可能与细胞因子发生相互作用，影响其稳定性或检测。
冻存前的处理： 如果样本在采集后没有及时处理（例如，没有及时离心去除细胞碎片或血小板，特别是对于血浆样本），样本中的蛋白酶活性可能在冻结前就已开始降解细胞因子。
三、 样本类型对检测结果的影响
不同类型的样本对冻存的耐受性不同，这也会影响细胞因子的检测：
血浆 (Plasma)： 通常含有较多的蛋白酶，因此血浆样本的细胞因子稳定性相对较低。如果血浆采集后未及时离心，血小板中的颗粒酶会释放出来，显著降解细胞因子。即使及时离心，也存在潜在的降解风险。
血清 (Serum)： 血清是血浆去除纤维蛋白和凝血因子后的液体。相比于血浆，血清中的凝血酶活性较低，理论上稳定性会好一些。但同样存在其他蛋白酶的降解问题。
细胞裂解液 (Cell lysates)： 如果细胞在裂解过程中释放了蛋白酶，并且这些酶没有被有效抑制（如添加蛋白酶抑制剂），细胞因子会迅速降解。裂解液的配方和处理过程至关重要。
细胞培养上清液 (Cell culture supernatant)： 如果细胞培养过程正常，且上清液采集后及时冻存，其细胞因子稳定性相对较好。但同样需要注意细胞本身的活性以及上清液中可能存在的少量蛋白酶。
四、 检测细胞因子的方法
目前主流的细胞因子检测方法包括：
ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay)： 一种常见的定量检测方法，依赖于特异性抗体与细胞因子结合。ELISA的灵敏度和特异性较高，但对样本的稳定性有一定的要求。
Luminex 平台 (Multiplex Immunoassay)： 可以同时检测多种细胞因子，效率高。同样依赖于抗体抗原的结合。
流式细胞术 (Flow Cytometry)： 可以检测细胞表面或细胞内的细胞因子，对于检测特定细胞亚群的细胞因子表达很有帮助。
质谱法 (Mass Spectrometry)： 可以直接检测蛋白质，但目前在检测低丰度细胞因子方面应用相对较少。
这些检测方法对蛋白质的完整性和构象都有一定要求，蛋白质的降解或变性都会影响检测的准确性。
五、 结论与建议
理论上可能检测到： 80℃冻存一年有很大可能仍然可以检测到一些相对稳定的细胞因子，但成功率和检测到的浓度水平会因多种因素而异。
成功率受多种因素影响： 样本类型、采集和处理过程（尤其是冻结前处理）、冻融次数、以及细胞因子本身的稳定性是决定能否成功检测的关键。
需要谨慎解读结果： 即使检测到了，也需要谨慎解读结果，因为长期的冻存可能已经导致一部分细胞因子降解或构象改变，检测到的浓度可能低于实际的原始浓度，或者存在假阴性。
最佳实践：
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总结：
样本在80℃冰箱冻存一年后，检测细胞因子是有可能检测出来的，但不能保证一定能检测到，并且检测结果的定量准确性可能会受到影响。 这是因为虽然80℃能显著减缓降解，但长期的冻存过程仍然可能导致细胞因子的部分降解、变性或聚集。因此，在进行此类检测时，需要对样本的原始质量、处理过程以及检测结果的潜在局限性有充分的认识。在条件允许的情况下，使用新鲜样本总是更优的选择。
网友意见
能，绰绰有余。零下 80 摄氏度保存的蛋白质降解速度非常慢。
实验证明，用于测定 IL-6、sIL-6R 和 CC16 的血清样品可以在零下 20 摄氏度下保存超过 1 年[1]。在零下 80 摄氏度下，IL-2、IL-4、IL-12 和 IL-18 可稳定保存 3 年，其余大部分细胞因子可稳定保存 2 年。在零下 80 摄氏度下保存 4 年后，IL-1α、IL-1β、IL-10、IL-15 和 CXCL8 明显降解[2]。
当然，这前提是样本里一开始有足够检测到的细胞因子浓度。随便抽的血直接检测都未必有细胞因子。
参考
- ^ Kenis G, Teunissen C, De Jongh R, Bosmans E, Steinbusch H, Maes M. Stability of interleukin 6, soluble interleukin 6 receptor, interleukin 10 and CC16 in human serum. Cytokine. 2002 Sep 7;19(5):228-35. PMID: 12393169.
- ^ de Jager, W., Bourcier, K., Rijkers, G.T. et al. Prerequisites for cytokine measurements in clinical trials with multiplex immunoassays. BMC Immunol 10, 52 (2009). https://doi.org/10.1186/1471-2172-10-52
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