如何判定荧光定量结果的真实性？

在荧光定量实验中，获得可靠的结果至关重要。它不仅关乎实验的成败，更影响着后续的分析和判断。那么，我们该如何辨别荧光定量结果的真实性呢？这需要我们从多个维度进行审视，不能仅仅依赖于最后的数据数字。

一、实验设计是根基：没有好的设计，再好的数据也可能是无稽之谈

在结果出来之前，最应该关注的是实验设计是否严谨。这是一个“预防为主”的思路。

明确的科学问题和假设： 你的实验是为了回答什么问题？你提出的假设是否合理且可验证？如果实验目的模糊，那么任何结果都难以判断其“真实性”。
合理的对照组设置： 这是荧光定量实验的灵魂。
阴性对照（No Template Control, NTC）： 必须包含，用于排除试剂污染（如引物、酶、dNTPs、水等）导致的非特异性扩增或背景荧光信号。如果NTC出现扩增，说明整个体系可能存在污染，所有结果都应受到质疑。
阳性对照（Positive Control, PC）： 如果有，可以验证试剂的活性和反应体系的有效性。阳性对照应该表现出预期的扩增，如果阳性对照没有扩增，可能说明试剂有问题，或者实验条件不当。
内参基因（Reference Gene/Housekeeping Gene）： 对于相对定量至关重要。内参基因的表达水平在实验处理前后应该相对稳定，用来校正常规PCR过程中样本间可能存在的RNA提取量、cDNA合成效率或扩增效率的差异。选择合适的内参基因（通常需要多个内参基因进行验证，评估其稳定性）是关键。
实验组与处理组的匹配： 实验组和处理组在样本数量、处理方式（除变量外其他条件一致）上应该尽量保持一致。例如，如果研究药物处理对基因表达的影响，那么对照组接受的是溶剂处理，而处理组接受的是药物处理，两者除了药物之外，其他所有培养条件（时间、温度、细胞密度等）都应该相同。
重复性：
生物学重复（Biological Replicates）： 这是评估结果真实性的最重要因素之一。至少需要3个独立的生物学重复，即从不同的生物个体或独立的培养批次获得的样本。只有当所有生物学重复都显示出相似的趋势时，结果才更具说服力。如果只有一个或两个重复，并且它们表现出较大的差异，那么结果的可靠性就会大打折扣。
技术重复（Technical Replicates）： 同一样本在同一个实验条件下进行多次检测（通常3次）。技术重复的目的是评估实验操作和检测本身的变异性。如果技术重复之间的ct值差异很大，说明操作不稳定或检测设备存在问题。良好的技术重复应该具有相似的ct值。
样本数量： 确保有足够的样本来支持统计分析，特别是对于检测群体差异的研究。过少的样本容易导致统计结果的偏差。
引物和探针的设计与优化：
特异性： 引物和探针的设计直接决定了检测的准确性。应确保它们能特异性地结合到目标序列上，避免与非目标序列结合。这通常需要通过生物信息学工具进行预测，并通过实验（如梯度PCR或熔解曲线分析）进行验证。
效率： 引物的扩增效率应尽可能接近100%，并且在不同样本之间保持一致。低效率或不一致的扩增效率会影响定量结果。
熔解曲线分析： 这是评估PCR产物特异性的重要手段。理想情况下，每个目标基因的熔解曲线应该只有一个清晰的峰，且峰的位置相对固定。如果出现多个峰或者峰形不规则，可能意味着存在非特异性扩增、引物二聚体或SNP等问题。

二、实验过程中的细节把控：每一个环节都可能埋下“定时炸弹”

即使设计再好，如果在实验过程中出现疏忽，结果同样会失真。

RNA提取和保存： RNA的质量对荧光定量至关重要。
RNA的完整性： 使用RIN值（RNA integrity number）来评估RNA的完整性。RIN值越高越好，通常要求RIN值大于7。降解的RNA会导致结果不准确。
RNA的纯度： 检测RNA的A260/A280和A260/A230比值。A260/A280比值应在1.82.0之间，A260/A230比值应大于2.0，表明RNA纯度较高，没有蛋白质、酚或盐的污染。
RNA的保存： RNA应在80°C条件下保存，避免反复冻融。
cDNA合成：
反转录酶的活性： 确保使用新鲜有效的反转录酶。
随机引物/Oligo(dT)引物： 选择合适的引物。
模板RNA量： 严格按照说明书的建议量加入模板RNA。过少或过多的RNA量都可能影响cDNA合成效率。
反应条件： 确保反转录反应的温度和时间符合要求。
PCR扩增：
试剂的稳定性： 使用新鲜、保存得当的PCR Master Mix（包含dNTPs、Taq酶、Buffer等）和引物。
反应体系的配制： 严格按照试剂盒的说明配制反应体系，确保各成分的浓度正确。
PCR程序： 优化PCR循环次数、退火温度、延伸时间和变性温度。
荧光染料的选择： SYBR Green还是TaqMan探针？两者都有其适用范围和注意事项。SYBR Green易于使用，成本较低，但对非特异性产物也敏感；TaqMan探针特异性高，但成本较高，设计和合成更复杂。
仪器校准和维护： 定期对荧光定量PCR仪进行校准和维护，确保其性能稳定。

三、结果分析与解读：数据背后的逻辑

即使实验过程无误，不当的分析也会导致错误的结论。

阈值（Threshold）的设定： 阈值的设定直接影响ct值的计算。阈值应该设定在荧光信号进入指数增长期，并且低于非特异性背景信号的区域。通常，在所有样本的荧光扩增曲线中，选择一个能够良好区分信号和背景的平坦的对数增长期区域。最好在所有实验中保持一致的阈值设定策略。
基线（Baseline）的校正： 基线是PCR反应初期的背景荧光信号。正确的基线校正能够去除背景信号对结果的影响。通常，基线范围设置为PCR程序的前几圈（例如，315圈），并确保基线校正不会误将早期出现的弱信号视为真实信号。
ct值的解读：
ct值越低，目标基因的初始表达量越高。
ct值与样本量、RNA质量、cDNA合成效率和PCR扩增效率相关。 因此，在进行相对定量时，必须使用内参基因进行校正。
熔解曲线分析的检查： 如前所述，熔解曲线是判断PCR产物特异性的重要依据。任何出现异常熔解曲线的样本（非特异性扩增、引物二聚体等）对应的ct值都应该被排除或谨慎解读。
相对定量（ΔΔCt法）的准确性：
内参基因的稳定性： 必须对内参基因的表达稳定性进行评估。可以尝试多个候选内参基因，并使用软件（如geNorm, NormFinder）来评估其稳定性。如果选择的内参基因在不同处理组或条件下表达不稳定，那么基于其进行的相对定量结果将是不可靠的。
选择合适的参照样本（Control Sample）： 相对于哪个样本进行定量？通常是未处理组或对照组。
计算公式的正确运用： 熟练掌握ΔCt和ΔΔCt的计算方法。ΔCt = 目标基因ct值 内参基因ct值。ΔΔCt = ΔCt (实验组) ΔCt (对照组)。Fold Change = 2^(ΔΔCt)。
绝对定量： 如果需要绝对定量（例如，检测病毒载量），则需要建立标准曲线。
标准品的制备： 标准品需要是已知拷贝数（或浓度）的目的DNA片段，并且其序列与样本中的目标序列一致。
标准曲线的线性范围： 标准曲线应具有良好的线性关系（R^2值接近1），并且ct值范围与样本的ct值范围相匹配。
检测效率： 标准曲线的斜率可以反映PCR的检测效率（理想值为3.1到3.6，对应90110%的效率）。低效率或不一致的效率会影响绝对定量的准确性。
统计学分析：
选择合适的统计学方法： 根据数据的分布和研究设计，选择合适的统计学检验方法（如t检验、ANOVA等）。
样本量和重复性： 确保样本量足够支持统计分析。
P值和置信区间： 理解P值的含义，并结合置信区间来评估结果的显著性和不确定性。
交叉污染的排查： 尽管我们在实验设计中提到了NTC，但在数据分析阶段也需要警惕交叉污染的可能性。例如，如果某个样本的ct值异常低，并且与旁边样本的ct值非常接近，可能存在交叉污染。

四、综合评估与验证：没有“万能药”，只有“多角度审视”

最终，判定荧光定量结果的真实性，是一个综合评估的过程，不能孤立地看待某一个方面。

结果是否符合生物学逻辑： 实验结果是否与已有的文献报道或已知的生物学机制相符？如果结果出乎意料，需要更加谨慎地审视实验设计和数据分析过程。
不同方法之间的印证： 如果可能，尝试用其他互补的技术来验证荧光定量结果。例如，如果荧光定量显示某个基因表达上调，可以通过Western Blot来检测相应蛋白的表达水平。
重复实验的稳定性： 如果有条件，进行独立重复的实验，看结果是否一致。一致的重复性是真实性的重要保证。
与同行的讨论： 与其他有经验的科研人员讨论你的实验设计、数据和结论，听取他们的意见和建议。

总而言之，判定荧光定量结果的真实性，需要我们像侦探一样，从实验设计、操作过程、数据分析到结果解读，层层深入地去审查。每一个环节都可能隐藏着导致结果失真的因素。只有通过严谨的科学态度和多角度的审视，我们才能获得真正可靠的实验数据，并在此基础上得出有意义的结论。记住，科学研究的严谨性在于每一个细节，而数据的真实性则建立在坚实的科学基础之上。

网友意见

如果你说的是荧光定量PCR的话：

根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。

典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。

根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。

在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。

定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。

1.终点定量不准确

理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是

S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA

模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的

Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR

反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大【1】。

传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。

2. CT值与起始模板拷贝数成线性关系

CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，可以看出DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比.

其数学证明为：

既第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB) 加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS) 与分子数目的乘积，， 是初始目标分子数， 是目标分子扩增效率, 是循环数， 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。

当循环次数时,

两边取对数，得;

整理得：

由上可得，对于每一个特定的PCR反应来说，、、和都是常数，所以值与成反比，也就是说，值与起始模板拷贝数()的对数成反比。

3.数据分析的几个概念【2】：

基线（Baseline）:扩增曲线中的水平部分；

调整原则：如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果；如果CT<18，修改终点，再分析一次；起点一般取3-6，终点一般取12-15.
阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值.

4.数据分析三部曲

①曲线分析（Amplification Plot）：

该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。

主要有整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造 成的异常曲线情况；

阴性对照分析：观察是否存在污染；

阳性对照分析：观察是否在质控范围内；

标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常。

②标准曲线分析（Standard Curve）

该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。

上图为外标定量方法原理图。

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

标准品与待测样本的扩增效率一致。 Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。

Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。

Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。

R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。

注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。

③定值浓度或Ct值：

通过上述步骤分析后，可以得到一个比较准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤中没有记录到异常曲线或者情况，则可以发出正确的报告，对于异常的曲线或者情况，则需单独分析，确定重复实验的必要性。

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参考文献

【1】《实时荧光定量PCR原理和实验》，陈云地，美国应用生物系统公司；
【2】《实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告》，周向阳，广西临床检验中心；

侵删。

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