韩春雨团队在《Nature Biotech》上发表的 NgAgo 基因编辑技术是什么？有何突破？ 第1页

110报警赞，来一波更新：

毫无疑问NgAgo近期在国内会被很多人跟进，最近已经遇到不少人来聊想重复NgAgo，把这个技术用在XXX，XXX和XXX里面。一系列深入探讨加深了我对这个技术的认识，所以更新一两点新的想法。

首先只有国内的同行们不大面积坑队友，NgAgo这个方向应该应该很快会炒热的。

但是NgAgo未来和CRISPR-Cas9（或者Cpf1）在基础科学的应用上，应该走的是完全不同两个路子。两者最大的区别在于guide的不同，一个使用DNA，一个使用RNA，将决定两种使用策略。而其他的差异并不是决定性的。

NgAgo使用ssDNA，因此在单个genome editing上要比用CRISPR-Cas9方便一点。CRISPR-Cas9使用RNA，不管是转染质粒也好，体外翻译也好，都需要相对繁琐的前期准备。而ssDNA从公司买回来就立即可用。因此高通量的工作可能是一个非常好的应用方向，如High-throughput library construction，NtAgo的系统会比Cas9时间成本和金钱成本都低。多位点编辑可能会有优势，有待检验。

NgAgo是外源注射一波流的，这一波很强，但是这波过去了，也就做不了啥了。

之前已经讨论过了靠内源表达guide的可能性基本为0。所以你不能指望像Cas9一样，把要用的guide RNA和Cas9以及其他组建都先装到基因组上，做可诱导的编辑甚至发育过程的预编程，比如像这篇在斑马鱼里的工作：A CRISPR/Cas9 Vector System for Tissue-Specific Gene Disruption in Zebrafish，Development Cell 2015；可以在发育过程中，在特定组织内进行编程。以及复杂的编程调控如epigenetic editing，NgAgo也很难灵活地实现。

至于临床应用，大家向来都是非常实用主义的，对于特定位点的单基因突变治疗哪个效率最高安全性最好用哪个，很多时候TALEN要比这些新技术效果好。我2014年还听到过一个UC Berkeley在申请的专利，和进入一期临床的HIV治疗方案，使用的甚至最老的ZFN（zinc-finger nuclease）的技术。所以实际上还没有谁替代谁的问题，只是多种选择。不过NgAgo因为ssDNA潜在的免疫应答的问题可能会局限于受精卵的基因编辑而非成体的基因治疗。

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谢邀，把我这个常年潜水党给炸出了真是诚惶诚恐。

欧洲时间大早上的时候就被刷屏了，所以我第一时间就把原文和最近相关的几篇文章看了遍。

详细的关于文章和课题组的介绍可以移步知识分子

。

我以下做一些简单的介绍，并针对性和这几年比较火热的CRISPR做些比较。

我个人的观点是个极具潜力的新技术，但是无法全面替代CRISPR。而且这篇文章实际上是Ago Genome editing的复兴。

1. 什么是Argonaute（Ago）？

Argonaute在真核细胞中被熟知参与RNA沉默，组装成复合物对靶点mRNA进行切割从而实现沉默，并被认为来自对RNA病毒的免疫机制。前人工作发现Argonaute在很多原核生物中的确会参与对病毒的“获得性免疫”，而且不但可以针对外源性RNA还可以切外源性DNA。

2. 什么是NgAgo？

这篇文章找到NgAgo是来自古细菌中的一种嗜盐菌Natronobacterium gregoryi的Argonaute蛋白。NgAgo结合24碱基长度左右的单链DNA（ssDNA），并由这段guide-DNA介导，切割具有相同/互补序列的双链DNA。

3. 这篇文章的主要贡献是什么？

文章最大的贡献是找到一个可以在常温下工作的使用ssDNA做guide的Ago同源蛋白，并证明是在人类细胞内NgAgo可以可编程地定点切割双链DNA从而实现基因组编辑。

而之前所有报道文献中的Ago同源蛋白都有各种问题以至于不能应用在人类基因组编辑中：多数来源于嗜热菌（van der Oost Lab的2014 Nature 【2】和2015 NAR文章【3】，Doudna Lab 2015 PNAS文章【4】），因此需要较高温度的工作环境或热激活（60-100℃）；Alexei A.

Aravin 2013 Mol Cell 文章【5】是一个比较复杂的机制，可以结合ssRNA定点切质粒，结合ssDNA定点切RNA，不实用，容易受到背景ssRNA的干扰。实际上除了已经发了不错的文章的这些工作，Ago作为Genome editing并不是一个全新的概念，很早就有很多组再做了，不过各有各的问题。iGEM 2009年就有人做了：

4. 和传统CRISPR基因编辑的区别以及优劣分别是什么？

可编程的基因组编辑目前最成熟有效的手段是CRISPR-Cas9，Cas9是一种单体蛋白，可以结合单链single guide-RNA（sgRNA），定点的切割sgRNA对应DNA。

对一个基因编辑工具，我们最关心的几个问题有：

-可靶向的序列

-切割的方式（切一条链？两条链？）

-切割酶的效率（NgAgo和Cas9应该差不多，后面不讨论了）

-使用、设计的便捷性

-识别序列的长度：太短了不行，会导致靶点太多

-脱靶率：涉及至少两方面，识别的特异性（对突变的容忍度），遗传背景的影响（系统正交性）

-拓展性：比如说多靶点同时编辑，比如说基因沉默等功能如何实现

1）不论是Cas9，Cpf1，CRISPR Cascade，都需要PAM位点（protospacer-adjacent motif ）的识别和sgRNA对靶向序列的识别。PAM的序列限制了Cas9等的靶点范围。而NgAgo不需要PAM位点，从而理论上可以定位于任何靶点。

而且由于PAM在Cas9的脱靶上贡献“极大”，所以没有PAM也可以提高相应的效率和特异性。原文比较了NgAgo和SpCas9，发现在GC含量高的区域NgAgo效率更高，而Cas9的PAM序列恰恰也是GC编码的。

不过PAM因为是Cas9解开DNA双螺旋的起始位点，其重要也是不言而喻的。没有PAM的类似物会使得NgAgo在平直的DNA上效率严重下降。

2）NgAgo切割的方式很有趣，会随机抹掉一段靶点内的序列

图片显示的对于GFP的切割，对20个实验结果进行测序后确定的被切割的部分。我觉得目前还不能下结论是好还是不好，需要进一步实验分析。我猜测可能是会使得同源重组修复变得更有效。

3）NgAgo使用的是 23~25-nt DNA，这是和CRISPR一票的系统最大的不同。

DNA相比RNA的优点也是明显的，DNA-DNA识别的精确度和效率理论上一般比RNA-DNA识别要高。文章测试了NgAgo对碱基错配的容忍度，单个碱基会明显降低效率，多个碱基错配完全失去活性。这是我认为对比Cas9最大的优势，Cas9有时候错配5、6个碱基一样可以切。

Figure 4.d （图传不上来什么鬼）图中G10是正确的gDNA，效率很高，一条高浓度的切割产物。而其他mN的错配gDNA效率要低很多

识别序列长了一点，差不多4个碱基，但是如知识分子的报道说理论上准确度提高了1024算是夸大报道的。。首先这个理论上的准确度也不是这么算的。而且讲道理Cas9识别序列总长gRNA+PAM也有25nt了。事实上19nt在目前绝大多数的基因组编辑就够用了，对于非重复序列能够保证单一靶点。

但是ssDNA的缺点和限制性也很多，下文详谈。一个比较明显的就是不能由靶细胞自己生产，用完了就没了。

4）NgAgo要比Cas9小太多了，很容易放到载体中用来做基因治疗。

5. NgAgo的gDNA和Cas9 sgRNA相比的劣势是什么？

两点：不依赖特殊结构，对长度有限制

gDNA不需要什么特殊结构，这是最大的劣势。也是我认为从根本上NgAgo不能取代Cas9的原因。有认为不依赖特殊结构是很大的优点的那些言论都是血外行。

搞个核酸结构费不了多大事，没有成本问题。但是没有一个特殊结构引发的问题却很多。

不依赖特殊结构，最严重的问题就是导致无法避免的背景的正交性不足：

1）遗传背景里面到底有多少ssDNA？人类细胞比较少，可喜可贺。但是别的物种呢？至少原核生物里面大量的ssDNA。因为不依赖特殊结构，是个ssDNA都能上，这就限制了系统的通用性，凡是ssDNA含量较高的物种都不能用。

2）Deliver引起的问题，如果ssDNA细胞自己没有NgAgo才能用，那ssDNA就不能由细胞自己生产，必须外源供给，降解了就没了（NgAgo和ssDNA结合不可逆，因此降解速率可能没那么高，但仍然比不上sgRNA可以自给自足）。知识分子的报道里面张翼提出了解决这个问题的几个优化方向，仔细想想都可行性都很差：

- 找一个生产ssDNA的方法。说实话做合成生物学的知道这种方法遍地都是，大多数基于反转录酶的，马上就有安全性问题。如果反转录用的RNA模板有特殊结构，就没有安全性问题，但是ssDNA还必须得可丁可卯23~25-nt的长度，不能有附加的部分，这种process是很困难的。如果反转录不要求模板的特殊结构，那么不但有安全性问题，而且没办法解决内源RNA被反转录成ssDNA，导致脱靶的问题。

- 找一个RNA介导的Ago。这个就是没看文献【5】。早在2013年就有RNA介导的Ago了，而且这款RsAgo室温就有活性。但是仍然不能用啊。使用ssRNA最大的问题就是内源ssRNA从原核到真核全都有，很难把内源的ssRNA和我们设计的ssRNA区分开。而且很多ssRNA都来自于mRNA的正常降解，扔个Ago进去简直到处都可以剪。

这里图C显示了RsAgo可以利用mRNA降解剩下的一些边角料作为guide（diRNA）切割外源质粒，并再用之列切下来的片段作为guide（riDNA）反过来切那些还没降解的mRNA，进行双重保险的高效免疫。

如果有特殊结构，正交性问题就没这么头疼了，只要分析一下内源RNAorDNA哪些有相应的特殊结构就可以估计背景。

其次没有特殊结构导致的系统内部的正交性会很差，比如：

3）当我们做真正的editing而不是仅仅做deletion的时候，需要再导入一条ssDNA做模板介导同源重组。那么这条ssDNA必须得足够长，否则到时候就会有gDNA和模板DNA竞争的问题。

最后对长度的限制基本上让NgAgo在除了基因编辑以外没什么拓展性可谈了。Ago结合13~25nt的ssDNA，这25个碱基全用来识别了。所以在ssDNA上我们不能设计任何其他功能了。

而Cas9技术在基础科学的应用上却可以玩的五花八门，全赖于其gRNA除了识别区段之外，还有很大的空间去设计其他功能，包括不限于：募集转录因子控制基因表达（Stanley Qi Lab），募集荧光蛋白进行定点标记（Stanley Qi Lab），加一段lncRNA用来研究非编码RNA的调控功能 （John Rinn Lab），招募一个单碱基置换的酶（David Liu Lab）etc.

（CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR activation (CRISPRa) for transcription repression and activation. Antonia A. Dominguez, Wendell A. Lim & Lei S. QiNature Reviews Molecular Cell Biology 2016）由于所有这些募集行为都可以设计在gRNA上，所以是定点发生的。如果同时在多个靶点上使用Cas9，每个靶点发生的反应不会串流：比如一个切割，一个激活基因，一个抑制基因。

而这种设计对于Ago是不可能的。很遗憾。

6. 为啥不能发个大新闻？

首先恭喜韩老师在如此艰苦的条件下能做出如此impressive的工作。

我觉得很可惜没能发表在Science上。虽然Nature biotech的影响因子要高于CNS任意一个，但是在大家心中的地位还是不如的。

@

说这是学术壁垒的问题。学术明星的确文章稍微好发表一些，所有的social community都有这种看脸的毛病。但是实际上没有那么严重，发Science都是很难的。

（就在基因编辑圈子里举个例子：Andy Ellington Lab之前2013年的时候在提倡一种基于内含子的“Targetron”技术（大概是这个名字），企图改变Cas9的垄断效应。当时和Cas9比各有优劣吧，但是

和我在2015年初去的Genome editing的峰会，Andy作报告的时候受众寥寥，后来也根本没人跟进。大家都觉得有Cas9就够了。原始的文章发的杂志远远不如Nat Biotech。而Andy Ellington和Jennifer Doudna是炸药奖得主Jack Szostak同窗的学生，当年一起发的ribozyme的文章，后来的发展也不错，算是RNA领域的大牛，然而并没有卵用。）

我觉得导致这次没能发个大新闻的主要原因还是：

穷！穷！穷！

上个月Science senior editor Melissa McCartney来我们学校介绍的时候给的统计数据：Science的审稿周期中最难过的一关其实是第一步editor board筛选（90%以上都被退回了），进入同行评议之后的淘汰率其实是50%，并没有那么高，只要能把两轮审稿人要求的实验都补上而且实验结果符合预期（这当然很不容易了），一般就发表了。

这篇文章据称是“审稿人要求的比较完美”所以被拒了。韩老师这篇文章，就凭目前已经发表的工作，我觉得投给Science还是会被评审要求补充实验的。

所以很可能没钱、没条件做这些实验才不得不放弃的吧。

比如说我觉得至少需要的一个补充的实验：

-NgAgo是不是会切割RNA？引用文献12 Olovnikov et al. 2013 Mol Cell的文章中Ago是RNA和DNA都能切的。如果NgAgo不是特异性切割DNA，也切割RNA的话，是不是会影响到内源RNA的表达？但是这个实验做起来不论体内体外都要麻烦许多。而且如果RNA-seq那又是大把的银子。

7. 结论：

不管怎样能够在艰苦的条件下做出这样的工作仍是可敬可喜的。

我相信Ago基因编辑也会发展成为一个小热点。前人已经体外【2】、体内【1】证明了Ago进行基因组编辑的可能性，只不过在体内都不实用（前者是因为高温，后者是因为使用ssRNA），而这篇文章找到了一个相对可靠地系统。所以我认为这篇文章在Ago未来发展中的地位应该和丛乐、张峰的文章在Cas9中的作用差不多，但是地位上可能稍高一些。

但是和CRISPR-Cas9相比，我认为目前来看还是很难全面替代的，而且根据我对Ago的了解，我也不持乐观态度。Ago有潜力部分替代Cas9，比如在人基因组编辑。

参考文献：

1. Gao F et al. Nature Biotech 2016

2. Swarts D C et al. Nature 2014

3. Swarts D C et al. NAR 2015

4. Kaya E et al. PNAS 2015

5. Olovnikov et al. Mol Cell 2013

6. Dominguez A A et al. Nature Review MCB 2016